黄仁发，梁群卿，黄国东，向少伟，黄海燕，胡 维，龙 韵，吴金玉

(1.广西中医药大学附属瑞康医院肾内科，南宁 530011;2.广西中医药大学附属瑞康医院健康体检中心，南宁 530011;3.广西中医药大学第一附属医院肾内科，南宁 530023)

加味六味地黄汤对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织Notch1/jagged-1信号通路的影响❋

黄仁发1，梁群卿2，黄国东1，向少伟1，黄海燕1，胡 维1，龙 韵1，吴金玉3Δ

(1.广西中医药大学附属瑞康医院肾内科，南宁 530011;2.广西中医药大学附属瑞康医院健康体检中心，南宁 530011;3.广西中医药大学第一附属医院肾内科，南宁 530023)

目的:观察加味六味地黄汤对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织Notch1、jagged1蛋白表达的影响。方法:健康成年SD大鼠90只，按随机数字表法分为假手术组、模型组、中药组3组。假手术组和模型组给予生理盐水(2 ml/只/d)灌胃，中药组给予加味六味地黄汤组灌胃(2 ml/d)。HE染色和Masson染色观察肾脏病理改变，免疫组化和Western blot观察大鼠肾组织Notch1、jagged1蛋白的表达。结果:假手术组大鼠肾组织结构正常，模型组大鼠出现肾间质纤维化，中药组大鼠小管间质病变减轻。与假手术组相同时间点相比较，模型组大鼠小管间质半定量评分、Notch1、jagged1蛋白表达均显著增高，差异有统计学意义;与模型组大鼠相同时间点相比较，加味六味地黄汤显著降低小管间质半定量评分、Notch1、jagged1蛋白表达。结论:加味六味地黄汤可能通过阻断Notch1/jagged1信号通路的活化，发挥抗肾间质纤维化作用。

单侧输尿管梗阻;肾间质纤维化;加味六味地黄汤;Notch1/jagged1信号通路

肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是各种终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)最终的病理改变。研究证实，RIF程度比肾小球硬化与肾功能减退的相关性更为密切［1］。因此目前一致认为，RIF是导致肾功能丧失最主要的病理生理过程。前期临床研究表明，六味地黄汤及其怡肾汤(六味地黄汤加桂枝、荆芥、大黄)能改善5/6肾切除大鼠肾脏病理，减少慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患者的蛋白尿，改善肾功能，降低血清纤维连接蛋白、IV型胶原纤维等致纤维因子，改善CKD患者的免疫功能，抑制微炎症状态［2-6］。最近我们的研究提示，Notch信号通路参与调控肾缺血再灌注损伤诱导的炎症和凋亡过程［7］。我们在临床中发现，大部分CKD患者均有疲倦乏力、水肿等脾气虚等症状，因此我们在怡肾汤基础上加黄芪，命名为加味六味地黄汤，取黄芪补气健脾利水之功。本研究拟探讨加味六味地黄汤对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾组织Notch1/jagged-1信号通路的影响，进一步明确其抗RIF的信号机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10～12周龄健康雄性清洁级 SD(Sprasue-Dawley)大鼠，体质量(210±34)g共90只，购自上海斯莱克景达实验动物有限公司(动物合格证号SCXK(湘)2009-0004)，在广西中医药大学实验动物中心饲养，在室温18～25℃、相对湿度50%～60%、人工12 h昼/夜循环照明环境中用全价营养、分笼饲养。每日定时清洗笼舍，大鼠自由摄食及饮水。

1.2 主要仪器与试剂

BX-50生物光学显微镜、水平电泳槽、Notch1多克隆抗体(santa cruz，sc-373891∶120kd);jagged1多克隆抗体(santa cruz，sc-16011∶150kd);SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司);蛋白提取试剂盒(上海申能博彩生物技术公司);BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天生物技术公司;PMSF (江苏碧云天生物技术公司);PDVF膜(苏州广惠科技有限公司)。

1.3 加味六味地黄汤药物组成及制备

加味六味地黄汤药物组成:熟地黄10 g，山茱萸10 g，干山药15 g，泽泻10 g，茯苓12 g，丹皮10 g，大黄10 g，桂枝10 g，丹参15 g，黄芪30 g，以上药物共132 g，均购自广西中医药大学附属瑞康医院药剂科。将药材用相当于药材5倍自来水浸泡2 h，煮沸后微火煎煮30 min，过滤、收集煎液，原药渣加少量水煎煮后得二煎。两煎液混合，于水浴恒温器上浓缩至浓度为每毫升药液含生药1 g。

1.4 单侧输尿管结扎大鼠模型的建立

大鼠造模方法按照既往方法进行［8］。大鼠适应性饲养1周，10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位固定，鼠背部左肋下备皮，常规消毒沿腋后线从左肋下向尾部方向剪开皮肤，钝性分离皮下肌层和组织，暴露左肾，并沿肾蒂向肾下极方向寻找输尿管，在输尿管上段行双线(4号丝线)结扎，两结扎点间剪断输尿管，逐层缝合皮下组织和皮肤。假手术组除不结扎输尿管外，其他步骤均相同。

1.5 分组与给药

健康成年SD大鼠90只，按体质量随机分为假手术组、模型组、中药组3组各30例。各组组内再随机分为1周、2周、4周3个时间点，每个时间点处死10只大鼠。假手术组和模型组给予生理盐水(2 ml/只/d)灌胃，中药组在造模后给予加味六味地黄汤药液(2 ml/只/d)灌胃，留取各组大鼠左肾组织检测相关指标。

1.6 指标检测

1.6.1 肾脏病理检测 取左侧1/2肾脏置于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中，将标本按顺序脱水、石蜡包埋、切片，行HE和Masson染色，于光学显微镜下观察肾间质的改变并摄像。按以下方法进行评估［9］:计算30个高倍视野(×400)肾皮质中发生损害(肾小管扩张、萎缩、管型、坏死或小管炎)的肾小管数目和总肾小管数，以损害的肾小管数占总肾小管数的百分比表示。肾间质纤维化程度进行半定量评估，分值为0～4分:0分为正常;1分为肾间质纤维化面积不超过视野25%;2分为25%～49%;3分为50%～75%;4分为超过75%。计算30个肾皮质高倍视野，求和、取平均数，得该标本肾间质纤维化分值。

1.6.2 免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织Notch1、jagged1蛋白表达 切片常规脱蜡至水，3% H2O2阻断灭活内源性过氧化物酶，0.01 M枸橼酸缓冲液煮沸修复抗原，山羊血清工作液封闭，分别滴加Notch1多克隆抗体(1∶150)、jagged1多克隆抗体(1∶150)，37℃孵育30 min，4℃过夜。DAB显色5～20 min，显微镜下观察大鼠肾组织蛋白表达量及部位，肾小管上皮细胞胞浆有棕黄色颗粒为阳性，不着色者为阴性。

1.6.3 western blot法检测各组大鼠肾组织Notch1、jagged1蛋白表达 取保存的肾组织50～100 mg在冰上剪成碎片，加入蛋白裂解液提取组织总蛋白。BCA法检测蛋白浓度。按Western blot步骤进行电泳、转膜，进行 Notch1多克隆抗体(1∶100)、jagged1多克隆抗体(1∶200)、β-actin多克隆抗体(1∶3000)免疫检测，蛋白条带用IPP图像分析软件检测其OD值，用β-actin蛋白作为内参对照，通过计算比值(OD目的蛋白/ODβ-actin)即目的蛋白表达量来分析Notch1、jagged1蛋白相对表达水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 15.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，方差齐用单因素方差分析，采用LSD多样本均数间两两比较，方差不齐用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 加味六味地黄汤对大鼠肾脏病理的影响

图1、2和表1显示，假手术组大鼠肾小球及肾小管间质基本正常。而模型组大鼠第1周开始出现肾小管萎缩、间质纤维化，之后病变逐渐加重，至第4周肾小管萎缩、间质纤维化达高峰。加味六味地黄汤处理可明显改善小管萎缩、间质纤维化等病变。半定量评分结果表明，与假手术组第1周、第2周和第4周相比较，模型组大鼠各时间点评分明显增高，差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组第1周、第2周和第4周比较，中药组各相同时间点大鼠肾小管间质评分降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 各组大鼠肾组织病理改变(HE×400)

图2 各组大鼠肾组织病理改变(Masson×400)

表1 各组大鼠肾小管间质半定量评分比较(n=10，±s)

表1 各组大鼠肾小管间质半定量评分比较(n=10，±s)

注:与假手术组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05

组别/时间点 1周 2周 4周假 手 术 组0.12±0.04 0.13±0.05 0.11±0.03模 型 组 1.87±0.68＊＊ 2.62±1.12＊＊ 4.12±1.64＊＊中 药 组 1.28±0.52△ 1.95±0.68△ 3.31±1.84△

2.1 加味六味地黄汤对大鼠肾组织Notch1、jagged-1蛋白表达的影响

图3～5显示，假手术组大鼠肾组织未见Notch1阳性蛋白表达，可见少量的jagged-1蛋白表达。而模型组大鼠第1周即可见到较多的Notch1、jagged-1阳性蛋白表达，随时间推移Notch1、jagged-1阳性蛋白表达逐渐增多，至第4周Notch1、jagged-1蛋白达高峰与假手术组相同时间点比较差异有统计学意义(P＜0.01)。经加味六味地黄汤治疗后，肾组织第1周、第2周和第4周Notch1、jagged-1蛋白表达均下调，与模型组相同时间点比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

图3 第2周各组大鼠肾组织Notch1蛋白表达(免疫组化×200)

图4 第2周各组大鼠肾组织jagged1蛋白表达(免疫组化×200)

3 讨论

Notch信号通路是一条进化上高度保守的细胞间信号通路，其作用广泛，参与细胞的生长、增殖、分化以及三维器官的发育等过程［10］，由一系列蛋白分子家族组成，包括Notch受体、其配体、正负修饰分子以及转录因子［11］。Notch信号分子具有高度保守性，但不同物种具体组成有所不同，人和老鼠均有4个Notch受体，即 Notch1-Notch4;在哺乳动物中，Notch配体共有5种，一般与Delta同源性高的称为Delta或Delta-like(DII)，与Serrate同源性高的称为Jagged，分别为DII 1、3、4和Jaggedl、2［11］。

图5 各组大鼠肾组织Notch1、jagged－1蛋白表达(western blot)

表2 各组大鼠肾组织Notch1蛋白表达(n=10，±s，OD目的/OD内参)

表2 各组大鼠肾组织Notch1蛋白表达(n=10，±s，OD目的/OD内参)

注:与模型组比较:△P＜0.05

组 别 1周 2周 4周假手术组0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模 型 组 0.25±0.12 0.37±0.09 0.58±0.13中 药 组 0.13±0.08△ 0.23±0.11△ 0.36±0.99△

表3 各组大鼠肾组织jagged-1蛋白表达(n=10，±s，OD目的/OD内参)

表3 各组大鼠肾组织jagged-1蛋白表达(n=10，±s，OD目的/OD内参)

注:与假手术组比较:＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05

组 别 1周 2周 4周假手术组0.09±0.03 0.08±0.01 0.10±0.02模 型 组 0.34±0.11＊＊ 0.54±0.15＊＊ 0.76±0.18＊＊中 药 组 0.19±0.10△ 0.28±0.13△ 0.45±0.07△

研究表明，在胚胎的器官发育期间，Notch信号通路保持较高的活性。然而一旦器官发育成熟，Notch信号通路活性即明显减弱或失活［12］。已有研究表明，Notch信号通路的活化参与了各种肾脏疾病。如David W.Walsh［13］等学者研究发现，糖尿病肾病时肾小管Jagged1/Notch1/HES1信号通路被激活，并可能作为转化生长因子-β1(ransforming growth factor β1，TGF-β1)的下游信号通路，与Gremlin共同参与了糖尿病肾病的发生发展。Morrissey等学者应用基因芯片筛选研究发现［14］，单侧输尿管梗阻大鼠模型的远端肾小管Notch1、3、4和jagged-1、2的基因表达均增加，TGF-β1可诱导人类肾小管上皮细胞的jagged-1表达，提示UUO大鼠模型存在TGF-β1依赖的Notch信号通路激活。JiriZavadil等学者的研究发现［15］，Notch/Jaggedl信号通路激活可调控 TGF-β1诱发的肾小管上皮细胞转分化(Epithelial-mesenchymal transformation，EMT)。因此，探讨Notch信号通路活化在RIF过程中具有重要的意义。

本研究结果表明，假手术组大鼠肾组织未见Notch1阳性蛋白表达，可见少量的jagged-1蛋白表达，这与以往的研究相一致［7］。而模型组大鼠第1周即可见到肾小管萎缩及RIF，至第4周则上述改变逐渐加重，而同样从大鼠第1周即可见较多Notch1、jagged-1阳性蛋白表达。随时间推移Notch1、jagged-1阳性蛋白表达逐渐增多，至第4周Notch1、jagged-1蛋白达高峰，这与肾脏病理的高峰期相一致，提示UUO大鼠肾组织重新活化Notch1/ jagged-1信号通路可能参与了RIF过程。进一步的研究表明，加味六味地黄汤可以改善RIF病理改变，而且可以抑制肾组织Notch1、jagged-1蛋白表达，提示加味六味地黄汤可能通过阻断 Notch1/jagged-1信号通路的活化抑制RIF过程。但加味六味地黄汤是否还能通过抑制其他信号通路发挥抗肾纤维化作用，尚需进一步研究。

［1］Kalluri R.EMT:when epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells［J］.J Clin Invest，2009，119(6):1417-1419.

［2］陈北阳，何泽云，龙若庭，等.怡肾汤对大鼠5/6肾切除术后残肾肾功能及组织形态学的影响［J］.湖南中医学院学报，2005，25(3):11-13.

［3］黄仁发，史伟，吴金玉.怡肾汤治疗慢性肾衰竭的疗效观察及对免疫功能的影响［J］.湖南中医药大学学报，2007，27 (6):52-54.

［4］黄仁发，隆献，吴金玉.怡肾汤对3～4期CKD患者血清LN、CV-Ⅳ和SOD、MDA的影响［J］.中国中西医结合肾病杂志，2009，10(5):421-422.

［5］康雷，黄仁发，向少伟.加味六味地黄汤对3～4期慢性肾脏病患者微炎症状态的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2011，10(12):1354-1359

［6］何泽云.六味地黄丸对5/6肾切除大鼠残肾肾小球化生的影响［J］.湖南中医学院学报，2004，24(2):1-3.

［7］Huang R，Zhou Q L，Veeraragoo P，et al.Notch2/Hes-1 Pathway Plays an ImportantRolein RenalIschemiaand Reperfusion Injury-Associated Inflammation and Apoptosis and the g-Secretase Inhibitor DAPT has a Nephroprotective Effect［J］.Renal Failure，2011，2(3):207-216.

［8］黄仁发，林心如，梁群卿，等.加味六味地黄汤对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织CTGF和MMP-2的影响［J］.中国中西医结合肾病杂志，2015，16(3):196-199.

［9］黄仁发，梁群卿，吴金玉，等.加味六味地黄汤对UUO大鼠肾组织TGF-β1及EMT的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2014，10(12):737-751.

［10］Brent McCright.Notch signaling in kidney development［J］. Current Opinion in Nephrology and Hypertension，2003，12:5-10.

［11］Kopan R，Ilagan MX.The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism［J］.Cell，2009，137:216-233.

［12］Schweisguth F.Notch signaling activity［J］.Curr Biol，2004，14:129-138.

［13］David W.Walsh et al.Co-regulation of Gremlin and Notch signalling in diabetic nephropathy ［J］. Biochimica et Biophysica，2008，178210-1782221.

［14］Morrissey J，Guo G，Moridaira K，et al.Transforming growth factor-beta induce renal epithelial Jagged1 expression in fibrotic disease［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13:1499-1508.

［15］Jiri Zavadil，Lukas Cermak，Noemi Soto-Nieves.Integration of TGF-b/Smad and Jagged1/Notch signalling in epithelial-tomesenchymal transition［J］.The EMBO Journal，2004，23:1155-1165.

Effects of Modified Liuwei Dihuang Decoction on the Notch1/jagged1 Pathway in the Rat’s Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

HUANG Ren-fa1，LIANG Qun-qing2，HUANG Guo-dong1，XIANG Shao-wei1，HUANG Hai-yan1，HU Wei1，LONG Yun，WU Jin-yu3△
(1．Nephrology department，the affiliated RuiKang Hospital of GuangXi University of traditional Chinese medicine，Nanning 530011，China;2．Health care central，the affiliated RuiKang Hospital of GuangXi University of traditional Chinese medicine，Nanning 530011，China;3．Nephrology department，the first affiliated Hospital of GuangXi University of traditional Chinese medicine，Nanning 530023，China)

Objective:To observe the effect of Modified Liuwei Dihuang decoction on the Notch1/jagged1 pathway in the rat’s kidney with Unilateral ureteral obstruction(UUO).Method:The 90 rats were individed into 3 groups randomly: sham group，Model group and Chinese medicine group.The rats both in the sham group and Model group were treated by intragastric administration of physiological saline，and the rats in the Chinese medicine group were treated by intragastric administration of Modified Liuwei Dihuang decoction.And the kidney pathology by HE and Masson stain，and the protein expression of Notch1，jagged1 in the kidney were detected by the way of immunohistochemistry and western blot.Result The kidney structure in the sham group is regular.And the renal interstitial fibrosis in the Model group rats is found. However，the kidney pathology is improved in the Chinese medicine group.Our results indicated that，the semi-quantitative scores，the protein expression of Notch1，jagged1 in the Model group are higher than those in the sham group.However，the Modified Liuwei Dihuang decoction treatment could reduce index including the semi-quantitative scores，the protein expression of Notch1，jagged1.Conclusion:Modified Liuwei Dihuang decoction could provide an anti-Renal interstitial fibrosis role by blocking the activation of Notch1/jagged1 pathway.

Unilateral ureteral obstruction;Renal interstitial fibrosis;Modified Liuwei Dihuang decoction;Notch1/ jagged1 pathway

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1401-03

2015-04-17

国家自然科学基金资助项目(81060292);广西自然科学基金资助项目(2014GXNSFAA118217);广西教育厅重点课题(201202ZD052);广西卫生厅重点课题(重2012029)

△通讯作者:吴金玉，女，教授，医学博士，Tel:0771-5855356，E-mail:wujinyu0109@sina.com。