王虹，吴琍，侯琳，崔文，陈庆峰，胡海燕

(青岛大学医学院，山东 青岛 266003 1 附属医院乳腺外科； 2 生物化学与分子生物学教研室)



·肿瘤专题·

家族性乳癌病人乳癌组织及血清miRNA-26a、143与195表达及意义

王虹1，吴琍1，侯琳2，崔文1，陈庆峰1，胡海燕1

(青岛大学医学院，山东 青岛 266003 1 附属医院乳腺外科； 2 生物化学与分子生物学教研室)

目的 探讨miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在家族性乳癌组织和血清中表达变化，以评价其对家族性乳癌早期诊断的潜在价值。方法 收集家族性乳癌、散发性乳癌病人的癌组织、癌旁正常组织及血清标本，并收集健康查体女性血清标本作为对照。提取血清及组织标本中的总RNA，进行逆转录和实时荧光定量PCR检测miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在组织和外周血表达情况。结果 乳癌组织中miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195的表达水平均明显低于癌旁对照组织(t=2.033～2.671，P<0.05)。家族性乳癌组织中miRNA-26a、miRNA-143表达水平低于散发性乳癌组织(Z=1.978、2.315，P<0.05)。乳癌病人血清miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195表达水平均明显低于对照组(Z=2.211～5.922，P<0.05)；家族性乳癌病人血清中miRNA-143、miRNA-195表达水平低于散发性乳癌组(Z=3.103、2.478，P<0.05)。miRNA-143在组织与血清中的表达水平呈正相关(r=0.545，P<0.05)。结论 miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在乳癌病人癌组织及血清中表达水平下调，可能成为乳癌筛查和诊断的潜在生物学指标；miRNA-143在家族性乳癌病人癌组织及血清中表达水平明显下调，可能成为家族性乳癌诊断的生物学指标。

微RNAs；乳腺肿瘤；逆转录聚合酶链反应

乳癌现已居我国女性恶性肿瘤死亡率之首，严重威胁女性健康[1-2]。在我国乳癌病人中,有5%～10%属于家族性乳癌[3]。家族性乳癌指一个家系中一级及二级亲属中有2个或2个以上原发性乳癌和(或)卵巢癌病人[3]。该病的主要特点有：发病人数多、发病年龄早、双侧多发等。乳癌病人的预后与其临床分期密切相关，而对其早期诊断非常重要。微小RNAs(miRNAs)是一类由18～25个核苷酸组成，内源性、进化上高度保守的单链非编码RNA，具有转录后基因调控功能。miRNAs 具有多种生物学功能，在细胞发育、分化、增殖、凋亡过程中发挥调控作用[4-6]。某些miRNAs表达水平在乳癌组织与正常乳腺组织中存在差异，如miRNA-10b、miRNA-125b、miRNA-145、miRNA-21、miRNA-155在乳癌组织中表达水平下降[7]。已有学者提出，循环血中miRNAs可以作为肿瘤及某些其他疾病的生物学标志物[8]。本研究旨在探讨miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在家族性乳癌组织和血清中表达的变化，以评价其对家族性乳癌早期诊断的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2013年我院乳腺外科住院的家族性乳癌病人20例，散发性乳癌病人24例，均为成年女性，术前未接受化疗、放疗及内分泌治疗，病理证实为浸润性乳癌。于我院查体的健康女性20例作为健康对照。

1.2 试剂及引物

RNAiso Plus及SYBR荧光定量PCR试剂盒(SYBR®Premix Ex TaqTMII)均购自宝生物工程(大连)有限公司；逆转录试剂盒(BioRT Two Step RT-PCR Kit)购自博日科技有限公司。引物以U6作为内参照，由上海桑尼生物科技有限公司设计并合成。见表1。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 TRIzol法提取总RNA 术前采集血清标本，术中取乳癌组织及癌旁对照组织(距肿瘤边缘≥5 cm)标本，置于-80 ℃超低温冰箱中储存备用。按照TaKaRa公司RNAiso Plus说明书的步骤提取组织及血清样本总RNA。用紫外线分光光度计检测总RNA浓度，每个样本检测3次取其平均值，所得A260/A280比值均在1.8～2.0之间。

1.3.2 茎环法逆转录合成cDNA 参照逆转录试剂盒(BioRT Two Step RT-PCR Kit)说明书提示加入试剂、引物及样本RNA，逆转录得到目标cDNA。每管反应总体系为10 μL，其中，样本RNA总量≤1 μL。反应条件为：55 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。

1.3.3 实时荧光定量PCR 参照TaKaRa公司SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR反应，仪器型号为Light Cycler®96(罗氏)。反应体系为10 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s；然后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共进行40个循环；融解95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s；最后50 ℃降温30 s。以U6作为内参基因，分别扩增同一样本的目标基因和内参基因，利用ΔCT方法[9]进行miRNA含量的相对定量。计算公式为2-△△CT。公式中的△CT=CT目标miRNA-CTU6，△△CT=△CT实验组-△CT对照组。

2 结 果

2.1 乳癌病人血清中miRNA-26a、miRNA-143及miRNA-195的表达水平

将对照组血清中miRNA-26a、miRNA-143和miRNA-195表达量设为1.00，乳癌组(散发性乳癌组并家族性乳癌组)、散发性乳癌组、家族性乳癌组血清中三者的相对表达量见表2。乳癌组血清中miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195相对表达量低于对照组(Z=2.211～5.922，P<0.05)；散发性乳癌组三者相对表达量低于对照组(Z=2.324～4.716，P<0.05)；家族性乳癌组血清中三者相对表达量亦低于对照组(Z=4.197～5.739，P<0.05);家族性乳癌组血清中miRNA-143、miRNA-195相对表达量低于散发性乳癌组，差异均有显著意义(Z=3.103、2.478，P<0.05)。

2.2 乳癌组织miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195的表达水平

表1 各引物序列及长度

乳癌组、散发性乳癌组、家族性乳癌组癌组织中3种miRNAs相对表达量见表3。乳癌组癌组织中miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195相对表达量低于癌旁对照组(t=2.033～2.671，P<0.05)；家族性乳癌组癌组织中3种miRNAs相对表达量低于癌旁对照组(Z=2.803～3.296，P<0.05)；散发性乳癌组癌组织中miRNA-26a、miRNA-195相对表达量低于癌旁对照组(Z=2.040、3.287，P<0.05)；散发性乳癌组癌组织中miRNA-143表达水平与癌旁对照组比较差异无显著性(Z=0.471，P>0.05)；家族性乳癌组癌组织中miRNA-26a、miRNA-143相对表达量低于散发性乳癌组，差异有显著意义(Z=1.978、2.315，P<0.05)。

表2 各组血清miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195的相对表达量比较

表3 各组组织miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195相对表达量比较

2.3 家族性乳癌组织与血清中miRNA-143表达水平的相关性

家族性乳癌病人癌组织与血清中miRNA-143的表达水平呈正相关(r=0.545，P<0.05)。

3 讨 论

乳癌的临床分期、肿瘤大小、腋窝淋巴结状况、病理类型及病人年龄均可影响病人预后。家族性乳癌占乳癌的5%～10%，预后较差。有些乳癌病人发现较晚，失去手术尤其是保乳手术机会，辅助治疗效果较差，预后不佳。乳癌的早期诊断已引起世界范围内的重视。

自2005年首次报道miRNA的表达变化与乳癌有关以来[7]，已有越来越多的miRNA被证实与乳癌发病有关，如miRNA-21[10]、miRNA-34a[11]和miRNA-155[12]等能促进恶性肿瘤的进展。

miRNA-26a在乳癌细胞系MDA-MB-231、 MCF-7、 MDA-MB-435中表达下调，其有抑制乳癌细胞克隆性增殖、迁移、介导试管中乳癌细胞凋亡、提高乳癌细胞对紫杉醇的敏感性等作用[13]。本实验结果中，miRNA-26a在乳癌组织及血清中表达均下调，且在家族性乳癌组织中表达量低于散发性乳癌组织。

人类miRNA-143位于第5号染色体，在胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、乳癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、骨肉瘤和白血病等多种肿瘤中低表达。有研究表明，miRNA-143可通过靶向抑制补体调节蛋白CD46蛋白的表达水平，提高乳癌细胞对补体杀伤系统的敏感性，降低其免疫抑制能力，从而促进肿瘤细胞坏死或凋亡[14]。本实验中miRNA-143在家族性、散发性乳癌组织及血清中表达均下调，在家族性乳癌表达量低于散发性乳癌，且组织及血清中表达水平呈正相关。

近来，许多学者先后发现miRNA-195在多种肿瘤中表达明显下调，如胃癌、肝癌、膀胱癌、肾上腺皮质癌等。miRNA-195在乳癌组织和细胞系中表达明显下调，该基因下调是由于其上游CpG岛甲基化引起，其表达水平与乳癌恶性程度呈负相关。本实验中，miRNA-195在乳癌组织及血清中表达均下调，且在家族性乳癌血清中表达量低于散发性乳癌。

综上所述，miRNA-26a、miRNA-143、miRNA-195在乳癌组织及血清中表达下降，可能成为乳癌诊断的潜在生物学指标。其中，miRNA-143在家族性乳癌组织及血清中表达低于散发性乳癌组，且组织和血清中的表达水平具有相关性，可作为家族性乳癌筛查和诊断的生物学标记物。

[1] HORTOBAGYI G N, DE LA GARZA S J, PRITCHARD K, et al. The global breast cancer burden:variations in epidemio-logy and survival[J]. Clin Breast Cancer, 2005,6(5):391-401.

[2] 邵志敏,沈镇宙,徐兵河. 乳腺肿瘤学[M]. 上海:复旦大学出版社, 2013:1-5.

[3] 解云涛,李满秀. BRCA1/2突变的家族性乳癌病人临床治疗策略[J]. 临床外科杂志, 2013,21(7):497-499.

[4] HE L, HANNON G J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation[J]. Nature Reviews Genetics, 2004,5(7):522-531.

[5] VASUDEVAN S, TONG Y C, STEITZ J A. Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation[J]. Science (New York, NY), 2007,318(5858):1931-1934.

[6] 张腾龙,张鹏,孟月生,等. 多发性骨髓瘤组织微小RNA-19 表达及其临床意义[J]. 齐鲁医学杂志, 2013,28(1):14-16.

[7] IORIO M V,FERRACIN M,LIU C G, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J]. Cancer Research, 2005,65(16):7065-7070.

[8] WEILAND M, Gao X H, ZHOU L, et al. Small RNAs have a large impact: circulating microRNAs as biomarkers for human diseases[J]. RNA Biology, 2012,9(6):850-859.

[9] KENNETH J, LIVAK, THOMAS D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J]. Methods, 2001,25(4):402-408.

[10]YAN L X, WU Q N, ZHANG Y, et al. Knockdown of miR-21 in human breast cancer cell lines inhibits proliferation, in vitro migration and in vivo tumor growth[J]. Breast Cancer Research, 2011,13(1):R2.

[11]LI L, XIE X, LUO J, et al. Targeted Expression of miR-34ausing the T-VISA system suppresses breast cancer cell growth and invasion[J]. Molecular Therapy, 2012,20(12):2326-2334.

[12]SUN Y, WANG M, LIN G, et al. Serum microRNA-155 as a potential biomarker to track disease in breast cancer[J]. PLoS One, 2012,7(10):e47003.

[13]GAO J, LI L S, WU M Q, et al. MiR-26a inhibits proliferation and migration of breast cancer through repression of MCL-1[J]. PLoS One, 2013,8(6):e65138.

[14]崔文景,周丽,张宏波,等. microRNA-143阻遏乳癌细胞免疫抑制的作用及其机制[J]. 中国生物制品学杂志, 2013,26(10):1440-1444.

(本文编辑 厉建强)

EXPRESSIONS OF miRNA-26a,143 AND 195 IN PATIENTS WITH FAMILIAL BREAST CANCER

WANGHong,WULi,HOULin,CUIWen,CHENQingfeng,HUHaiyan

(Department of Breast Surgery, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the expressions of miRNA-26a, miRNA-143, and miRNA-195 in serum and tissue of patients with familial breast cancer (BC) and assess their potential value in the early diagnosis of this type of malignancy.MethodsCancer and paraneoplastic tissue and serum specimens of patients with familial and sporadic BC were collected, and healthy serum samples collected from women who came for medical examination were served as controls. Total RNA were extracted from all the serum and tissue samples, the expressions of three miRNAs (miRNA-26a, miRNA-143, miRNA-195) were quantified by using real-time PCR technique.ResultsThe expressions of miRNA-26a, miRNA-143 and miRNA-195 in cancer tissues were lower than that in paraneoplastic specimens (t=2.033-2.671,P<0.05), and that in familial BC were lower than that in sporadic BC (Z=1.978,2.315;P<0.05). The expressions of serum miRNA-26a, miRNA-143 and miRNA-195 in the BC patients were lower than that in the normal controls (Z=2.211-5.922,P<0.05), that familial BC were lower than that in sporadic BC (Z=3.103,2.478;P<0.05). A positive correlation was noted between tissue miRNA-143 expression and serum miRNA-143 (r=0.545,P<0.05).ConclusionDown regulation of serum and tissue miRNA-26a, miRNA-143 and miRNA-195 in breast cancaer patients is likely to become a potential biological parameter for screening and diagnosis of breast cancer, and significant down regulation of tissue and serum miRNA-143 in familial breast cancer can probably become a biological parameter in the diagnosis of this familial malignancy.

microRNAs; breast neoplasms; reverse transcriptase polymerase chain reaction

2014-09-16;

2015-05-05

山东省自然科学基金(ZR2012HM089)与青岛市科技局资助项目(12-1-3-5-(3)-nsh)

王虹(1987-)，女，硕士研究生.

吴琍(1967-)，女，硕士，主任医师，硕士生导师。侯琳(1962-)，女，博士，教授，博士生导师。

R737.9

A

1008-0341(2015)04-0379-04