薛佳佳,于之清,赵莹,李文,马金友,余燕

（河南科技学院,河南新乡453003）

甘油三酯（triacylglyceride,TG）是高等真核生物脂肪的主要储存形式,其水解过程是机体主要的能量来源.脂滴（lipid droplets,LD）是一个以中性脂为核的细胞器,动物能量摄入不足时,以LD形式储存的TG在脂肪酶的作用下分解为甘油和游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）,进而氧化分解为机体供能.较早被发现的脂肪酶是激素敏感酯酶（hormone sensitive lipase,HSL）,因其对激素高度敏感而得名.起初,人们一直以为HSL是催化甘油三酯发生脂解反应的唯一关键酶和限速酶[1].但随着HSL基因敲除小鼠的出现,这一结论受到质疑.2004年,三个独立的科研小组同时证明了甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase,ATGL）这种non-HSL是催化机体TG反应第一步中起着关键作用的酶[2-4].现在认为,正常情况下ATGL和HSL以一个连续的方式调节脂肪代谢,即：ATGL水解TG为DG和FFA,HSL再水解DG为单酰甘油和游离脂肪酸,单酰甘油再从糖骨架上最终裂解出脂肪酸和甘油,脂肪酸经β-氧化进入三羧酸循环释放能量.在哺乳动物中,ATGL主要分布在脂肪组织,但在心脏、肝脏、肺脏、肌肉等器官组织中也有少量分布[3,5-6].禽类有关ATGL的研究主要集中在脂肪组织上[7-8],而对其他组织的研究相对较少.本文通过qRT-PCR技术,对18日龄鸡胚的15种组织进行研究,旨在为进一步研究该基因在禽类不同组织中的功能提供基础资料.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物与取材 挑取蛋质重在65～70 g的Ross肉鸡受精蛋（河南大用鸡场）10枚,放入智能自动孵化器（山东德州孵化设备厂）中孵化.孵化条件：37.5±0.2℃,相对湿度（55±2）%.在孵化的第18胚龄（E18）,随机选取6只鸡胚,按每100 g体质量100 mg乌拉坦麻醉后,心脏取血处死,分别采集脾脏、腿肌、胸肌、十二指肠、回肠、空肠、肝脏、卵黄囊、腺胃、皮下脂肪、肺、心脏、下丘脑、肾、法氏囊共15种组织,用预冷的的0.01 mol/LPBS（pH 7.4）冲洗,液氮冷冻后转移至超低温冰箱内保存,用于mRNA表达分析.

1.1.2 引物设计 根据NCBI GenBank鸡ATGL（NM_001113291）和 β-actin（NM_205518）的基因序列,使用Primer Premier 5.0设计引物GatglF：GTGAAGAAAGCCAAGAAGAAGCTG,GatglR：ACAAGCTGACGCT GGTACTCC；GactF：TCCACCGCAAATGCTTCTAAAC,GactR：CTGCTGACACCTTCACCATTCC,由上海生物工程技术有限公司合成,扩增片段大小分别为194 bp和169 bp,其中β-actin为内参.

1.2 试验方法

1.2.1 鸡胚ATGL总RNA提取及cDNA合成 液氮中进行组织研磨,使用TRIzol reagent、氯仿、异丙醇、DEPC水、无水乙醇提取E18各组织样品总RNA,用Rnase free water充分溶解,仪器检测浓度,-80℃保存备用.取1μg总RNA,进行去除基因组DNA反应后,根据Takara反转录试剂盒说明以RT Primer Mix为引物合成cDNA.

1.2.2 各组织ATGL cDNA PCR扩增 以各组织cDNA为模板进行半定量PCR扩增反应.反应体系：Taraka Premix Ex Taq（loading dye mix）12.5 μL,引物 1 μL（F+R）,cDNA 2 μL,dH2O 9.5 μL,总共 25 μL.以管家基因β-actin做参照,半定量PCR扩增反应体系同上.扩增条件为：98℃、30 s,98℃、10 s,55℃、30 s,72℃、70 s,30个循环,72℃延伸5 min,4℃终止反应.扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离,在BIO-RAD Quantity One Basic凝胶成像系统拍照.

1.2.3 ATGL转录表达的实时定量PCR 实时定量PCR（qTR-PCR）按照SYBR premix Ex TaqⅡ（Takara,RR820A,Dalian,China）试剂盒指导说明配制,反应在 ABI 7300（Applied Biosystems,Marsiling,Singapore）仪器上完成.反应体系如下：总体积 20 μL,其中 2×SYBR mix 10.0 μL,正反引物各 0.5 μL（20 μM）,dye II 0.4 μL,cDNA 2 μL（标准曲线确定为 1∶10 稀释）,补充灭菌双蒸水至总体积为 20 μL；每个样品 3 个重复.反应程序如下：95℃、30 s,95℃、5 s,58℃、20 s,72℃、34 s,40个循环；在第二阶段第三步收集荧光数据（72℃、34 s）.同时,运用熔解曲线分析确认引物扩增的特异性.试验重复3次.反应结束后,根据ABI 7300仪器数据包运用2-△△CT法对相关实验数据进行分析.

1.3 数据处理

数据应用 SAS软件（version 8.01；SAS Institute,Cary,NC）进行多重比较（post hoc test）统计分析,P＜0.05为差异显著.

2 结果与分析

2.1 鸡胚各组织总RNA的提取和引物特异性检测

提取到的总RNA经1.2%的琼脂糖凝胶电泳,可见28S、18S和较弱的5S三条rRNA条带,提示RNA完整,微量分光光度计检测,A260/A280均在1.8～2.0范围内.反转录后,以cDNA为模板扩增,可见189 bp和169 bp两条带（见图1）,未出现非特异性条带,说明引物特异性高.

图1 ATGL在E18胚龄鸡胚各组织中引物特异性电泳图Fig.1 Electrophoretic map of ATGL primer specificity in different tissues of chicken embryos on E18

2.2 鸡胚各组织ATGL m RNA的qRT-PCR检测

荧光定量PCR检测结果表明（见图2）,ATGL mRNA的表达水平在皮下脂肪中最高,为11.38,显著高于其他组织（P＜0.05）,其次是卵黄囊（5.117）,在腿肌、十二指肠、空肠、回肠、肝脏、腺胃、肺、心脏、丘脑、肾脏、法氏囊等组织中表达量较低（分别为 1.000、0.553、0.445、0.234、0.222、1.379、5.117、0.970、0.797、2.893、0.761、0.475、0.788）,而在脾脏中没有检测到 ATGL mRNA 的表达.

图2 E18鸡胚ATGL组织分布Fig.2 Tissue distribution of ATGL in chicken embryos of E18

3 讨论

本文对E18鸡胚15个组织ATGL的分布进行了研究,结果表明,E18鸡胚皮下脂肪中ATGL mRNA表达水平显著高于其他组织,这与Lee等[7]对21日龄鸡ATGL组织分布的研究结果相同.同时,我们发现卵黄囊中ATGL mRNA也显著高于其他组织,这可能是由于E18鸡胚的营养主要来源于卵黄囊.然而,在胚胎阶段卵黄囊中的脂肪动员并不需要ATGL参与[9-10],具体原因还有待于进一步研究.此外,ATGL mRNA在鸡胚心脏等组织中也有少量表达,而且表达量也有差异,这与Lee等[7]的研究结果也是一致的,说明ATGL的表达不但存在于脂肪细胞,在有脂滴的细胞或组织具有表达,表达量的多少可能和该组织或细胞中脂肪细胞或脂滴含量多少有关.本试验在脾脏组织中未检测到ATGL mRNA的表达,这可能与该组织中ATGL含量极低有关.研究结果表明ATGL在鸡胚的多种组织中都有分布,尤其在脂肪含量高的组织中表达量相对较高,其在各组织中表达的差异性也说明ATGL的分布具有组织特异性.

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