孙科，周凤侠

（1.徐州生物工程职业技术学院生物工程系，江苏徐州221006；2.中央农业广播学校徐州分校，江苏徐州221000）

传统的黑曲霉发酵生产柠檬酸主要以薯干为原料，2010年以来由于薯干价格大幅度上涨，致使柠檬酸发酵行业成本大幅提高[1-2]。而纤维素经过处理也可以产生可发酵性糖，上世纪末对纤维素作为发酵的原料研究较多，本文研究了实验室保藏的黑曲霉XSY0607菌株以水稻秸秆为原料发酵柠檬素的培养基的优化，目的是解决柠檬酸发酵过程中产生的问题，尽可能的降低成本，提高产品质量。

1 材料与方法

1.1 试验材料与培养基

1.1.1 菌种

黑曲霉（Aspergillus niger）XSY0607：实验室保藏菌种。

1.1.2 斜面培养基[3-4]

羟甲基纤维素钠（CMC-Na）：0.5%；酵母膏：0.15%；（NH4）2SO4：0.2%；琼脂：2%；pH：自然。

1.1.3 种子培养基[5]

水稻秸秆粉：5%；小麦麸皮：0.5%；（NH4）2SO4：0.25%；玉米粉：1%；CaCl2：0.1%；pH：自然。

1.1.4 发酵培养基[6-7]

水稻秸秆粉：5.5%；（NH4）2SO4：0.16%；MgSO4：0.02%；蛋白胨：3%；KH2PO4：0.2%；CaCl2：0.001%；ZnCl2：0.000 2%；尿素：0.02%；pH：5.0。

1.1.5 发酵原料

水稻秸秆：粉碎过60目筛；麸皮：过60目筛；黄豆饼粉：过60目筛；（NH4）2SO4（分析纯）：北京裕策达科贸有限公司；MgSO4（分析纯）：深圳市博林达科技有限公司；CaCl2（分析纯）：天津迪博化工股份有限公司；KH2PO4（分析纯）：上海垒固仪器有限公司；ZnCl2（分析纯）：天津市北辰方正试剂厂。

1.2 试验仪器与方法

1.2.1 仪器

恒温水浴锅：上海一凯仪器设备有限公司；FA1204B电子分析天平：上海精科天美贸易有限公司；LRH-70生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；XSP-SG-63X显微镜：上海光学仪器厂；723N可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；MP512-03精密pH计：上海精密仪器仪表有限公司；LC-100高效液相色谱：上海伍丰科学仪器有限公司；7L实验室不锈钢发酵罐：镇江贝利生物工程有限；SW-CJ-2F超净工作台：上海阳光实验仪器有限公司；TGL-18C高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；MLS-3780高压蒸汽灭菌锅：杭州亚旭生物科技有限公司；Ba-1旋转式摇床：江苏省金坛市环宇科学仪器厂；FCW系列超微粉碎机：青岛即墨市超微粉碎机厂。

1.2.2 菌株培养方法

在无菌条件下，取出保藏的菌种黑曲霉（Aspergillus niger）XSY0607，接种到斜面培养基上，30℃活化培养48 h，然后转接如茄形瓶中，30℃恒温培养24 h。再用无菌水洗下茄形瓶中成熟孢子，接入500 mL三角瓶装有50 mL种子培养基，30℃150 r/min震荡培养28 h。然后将种子液转接至装有发酵培养基的7 L小型不锈钢发酵罐中，通风搅拌培养5 d。

1.2.3 柠檬酸测定的方法

采用高效液相色谱法测定柠檬酸的含量[4，8-9]。

2 结果与分析

2.1 碳源对产酸的影响

分别以5%水稻秸秆粉、小麦秸秆粉、玉米秸秆粉、木屑粉、青草粉过60目筛作为碳源，进行小型发酵罐的发酵试验，发酵5 d后，通过高效液相色谱仪测柠檬酸产量，结果如图1所示。

图1 碳源对产酸的影响Fig.1 Effect of carbon source on acid production

由于纤维素酶是诱导酶，所以采用了5种天然的纤维素作为碳源。一可以诱导纤维素酶的产生，二来可以解决成本，三可以尝试为柠檬酸发酵开辟更广的原料来源。从图1可以看出：5种纤维素原料作为碳源，水稻秸秆产酸能力最强，其次是玉米秸秆，产酸能力最差的是木屑，可能是木屑中含有大量的木质素有关。

2.2 氮源对产酸的影响

分别以过60目筛的黄豆饼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆和尿素作为氮源，进行小型发酵罐的发酵试验，发酵5 d后，通过高效液相色谱仪测柠檬酸产量，结果如图2所示。

图2 氮源对产酸的影响Fig.2 Effect of nitrogen source on acid production

从图2可以看出：5种氮源对柠檬酸的产量的影响不同，蛋白胨对黑曲霉XSY0607菌株产酸能力影响最大，其次是尿素，再次是玉米浆，最后是黄豆饼粉。所以，黑曲霉XSY0607发酵生产柠檬素最好的氮源是蛋白胨。

2.3 表面活性剂对产酸的影响

表面活性剂可以增加黑曲霉细胞膜的透性，有利于纤维素酶的分泌，同时也有利于柠檬酸的分泌。本实验分别在培养基加入0.1%的吐温-80、SDS、胆汁酸和聚乙二醇作为表面活性剂，寻找对柠檬酸发酵最适的表面活性剂。试验结果如图3所示。

图3 表面活性剂对产酸的影响Fig.3 Effect of surfactant on acid production

从图3可以看出：几种表面活性剂都能很大的促进柠檬酸的产量，都比空白对照组的产量要高的多；其中对柠檬酸产量影响最大的是聚乙二醇，其次是吐温-80，最后的是胆汁酸。本实验采用聚乙二醇作为柠檬酸发酵的表面活性剂。

2.4 初始pH对产酸的影响

用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH调节发酵培养基的初始pH，考察不同的初始pH对柠檬酸产量的影响。结果如图4所示。

图4 初始pH对产酸的影响Fig.4 Effect of initial pH value on Acid Production

从图4可以看出：当初始pH为6.5时，柠檬酸产量最高，说明偏酸的环境条件有利于酶的产生和分泌，同时有利于产物合成；对于通过发酵罐的液体发酵，当初始pH低于5.0时，纤维素酶产生减少，致使纤维素不能很好的糖化，从而使营养物质缺乏，生产缓慢，产酸能力弱。当初始pH高于7.0时，黑曲霉的菌体容易自溶，并且容易导致菌体提早老化，产酶时间缩短，并且酶易失活，产酸能力下降，甚至不产酸。所以，当初始pH为5.5～6.5范围内，有利于黑曲霉酶的产生和分泌，同时有利于产物的合成。

2.5 发酵培养基的优化

通过单因素试验，选择碳源、氮源、表面活性剂和初始pH4个因素作为影响黑曲霉产酸培养基配比的主要因子，分别以不同浓度选择3个水平，设计四因素三水平的L9（34）正交试验。因素水平见表1，正交试验结果见表2。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test

由K值看出发酵培养基最优的配方为A3B2C2D3，正交8号A3B2C1D3柠檬酸产量最高为78.4 mg/mL，为了得到真正的最优培养基配方，设计了验证试验。试验结果表明，其他条件都一致的情况下，配方A3B2C2D3的柠檬酸产量为72.8 mg/mL，配方A3B2C1D3的柠檬酸产量为78.4 mg/mL。所以，最优的发酵培养基配方应为A3B2C1D3。

从表2可以看出：极差R计算结果表明，培养基中对柠檬酸产生影响的顺序是：碳源＞初始pH＞表面活性剂＞氮源。验证试验结果表明，黑曲霉XSY0607的发酵培养基优化配方为A3B2C1D3，即培养基中碳源6%、氮源5%、表面活性剂0.1%、初始pH 6.5。

3 结论

通过单因素试验和正交试验得出黑曲霉XSY0607利用纤维素发酵产生柠檬素，得到最优的培养基的条件为A3B2C1D3，即培养基中碳源6%、氮源5%、表面活性剂0.1%、初始pH6.5。该试验结果为黑曲霉XSY0607菌株利用纤维素作为原料发酵生产柠檬酸的工业化生产和应用提供了一定的参考。

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