杜永华，蒲忠慧，魏琴，尹礼国，张萍，徐莉，张琪

（1.宜宾学院发酵资源与应用四川省高校重点实验室，四川宜宾644007；2.绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳621006；3.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾644007）

多糖（polysaceharide）是一类天然大分子化合物，存在于动植物和微生物中，为生命物质的组成成分之一。大量药理及临床研究证实，多糖有提高机体的免疫力、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、降血糖和降血脂等生理功能[1-9]。因此，对多糖的研究已成为各国学者关注的焦点。

仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）是石蒜科仙茅属植物仙茅的干燥根茎，具有抗缺氧、抗高温、镇静、抗惊厥、抗炎、抗骨质疏松、增强免疫功能、抗衰老[10]、促进乳腺发育[11]、延缓生殖系统老化和雄激素样[12]作用等功效，其中多糖类化合物是仙茅根中重要的药效成分。周勇等[13]研究表明仙茅多糖具有免疫调节和抗肿瘤等作用。有关仙茅多糖提取工艺的报道极少，聂诗明等[14]采用正交试验以仙茅苷和仙茅多糖为评价指标优选仙茅水煎煮工艺。本研究拟采用均匀设计法对仙茅多糖的提取工艺和含量测定进行研究，以期为仙茅进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

仙茅根：产地为四川，购自于四川宜宾正源药业有限公司，由其鉴定为石蒜科植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的干燥根茎。

所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；旋转蒸发仪R502B：上海亚荣生化仪器厂；紫外可见分光光度计：北京谱析通用仪器有限公司；TCL-16C型高速离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 仙茅粗多糖的提取

参考季春[15]的方法提取仙茅粗多糖。将市购仙茅粉碎，筛选出80目～100目的细粉于50℃烘箱内烘干，取50 g，按比例加入蒸馏水回流提取，过滤，浓缩至约100 mL，再将浓缩液用Savage法除蛋白，即是向浓缩液中加其1/4体积的三氯甲烷，随之再加入三氯甲烷体积1/4的正丁醇，剧烈振摇5 min～10 min，混匀，以1 500 r/min离心20 min，分去水层与有机层交界处的变性蛋白质，水层仍按照此方法反复除蛋白5次：然后在上清液中加入95%乙醇调含醇量为80%，沉淀过夜。沉淀用布氏漏斗抽滤，然后用无水乙醇和丙酮反复多次抽洗，直至沉淀呈粉末状时将其置于表面皿中。将表面皿于60℃干燥至恒重即得仙茅多糖粗品，计算粗多糖得率。

1.3.2 提取工艺优化

采用均匀设计试验，选取对提取率影响较大的因素：提取温度（χ1）、液固比（χ2）、浸泡时间（χ3）、提取时间（χ4），进行U10（104），即四因素十水平均匀设计优选提取仙茅多糖（见表1），每个因素10水平，以仙茅多糖得率为指标确定最佳提取工艺。试验安排方法见表2。

表1 仙茅提取工艺均匀设计因素水平表Table 1 Factors and levels of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Curculigo orchioides Gaertn

续表1 仙茅提取工艺均匀设计因素水平表Continue table 1 Factors and levels of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Curculigo orchioides Gaertn

表2 仙茅提取工艺均匀设计试验方案Table 2 Pilot programs of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Curculigo orchioides Gaertn

1.3.3 含量测定

采用苯酚-硫酸比色法测定粗多糖中仙茅总糖含量。按照以下公式计算仙茅多糖含量：总多糖提取率/%=（粗多糖提取物总重量×粗多糖中总糖含量）/仙茅质量×100

粗多糖得率/%=粗多糖净重/仙茅质量×100

1.3.4 验证试验

按照仙茅苷提取的优化条件进行验证试验。

1.3.5 数据统计

采用Uniform Design Version3.00对试验结果进行后退回归分析，根据回归方程的回归系数、F值及其显著性检验，由软件采用单指标Ⅰ型可约束条件试验优化方案选取优化工艺。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线回归方程如下：y=0.007 6x+0.025 6，决定系数 R2=0.996 8，

式中：y为吸光度，x葡萄糖标准曲线中对应的葡萄糖质量浓度（μg/mL）。

2.2 均匀设计试验结果

采用均匀设计试验安排的仙茅浸膏的提取结果及仙茅苷提取率结果见表3。

表3 仙茅粗多糖的得率及总多糖的含量Table 3 Yield and total polysaccharide content of Curculigo orchioides Gaertn polysaccharides

由表3可知，在仙茅粗多糖净重和得率方面：7号试验组最少，分别为8.49 g和16.98%；9号试验组最多，分别为10.64 g和21.28%。9号试验组的提取条件为提取温度95℃，液固比30倍，浸泡时间30 min，提取时间30 min。

根据标准曲线回归方程计算出各试验样品中仙茅总糖含量表示：在仙茅总多糖质量和多糖提取率方面：2号试验组最低，分别为1.28 g和2.56%；8号试验组最高，分别为2.98 g和5.97%。8号试验组的提取条件为提取温度90℃，液固比15倍，浸泡时间135 min，提取时间150 min。

2.3 均匀设计试验统计分析

采用Uniform Design Version 3.00对试验结果进行后退回归分析，在显著水平α=0.10时，第一次回归方程为Y=2.927 9+0.042 0X1-0.040 2X2+0.000 9X3-0.006 1X4，复相关系数 R=0.924 4，F检验值（7.342）＞F临界值（3.520），回归方程显著。各方程对回归的贡献值（偏回归平方和）U1（2.843）＞U2（2.613 7）＞U4（0.963 0）＞U3（0.012 6）。将第三方程项X3进行显著性检验，F检验值（0.0523）＜F临界值（4.060），方程不显著，剔除方程项X3。新建回归方程为Y=2.932 1+0.042 9X1-0.041 2X2-0.006 0X4，复相关系数 R=0.923 6，F检验值（11.60）＞F临界值（3.289），方程显著。再次对贡献最小的方程项X4进行显著性检验，α=0.10，F检验值（4.717）＞F临界值（3.776），方程显著，不需再剔除方程项。新建回归方程的显著性检验变量分析和残差分析见表4和表5。

表4 变量分析Table 4 Variance analysis

表5 回归模型残差分析Table 5 Residual analysis of regression equation

根据新建回归方程，采用网格尝试法单指标Ⅰ型可约束条件试验优化方案，优化试验条件，得到仙茅粗多糖的最佳提取工艺：提取温度为100℃，液固比为10 ∶1（mL/g），提取时间为 30 min。在此条件下，仙茅总多糖的预期得率为（6.63±0.87）%。

2.4 均匀验证

称取80目～100目的上述仙茅粉50 g，于50℃烘箱内烘干，以提取温度100℃，液固比10∶1（mL/g），提取时间30 min为提取工艺，用水回流提取，过滤，滤液60℃减压浓缩，浓缩液（约100 mL）用95%乙醇调含醇量为80%，静置过夜，过滤取沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤，常温真空干燥，采用蒽酮-硫酸法测定仙茅多糖的含量。结果：粗多糖得率为21%，总多糖提取率为6.18%。

3 结论

通过对均匀设计法优化仙茅粗多糖提取工艺的研究，结果表明提取温度、液固比、提取时间对仙茅总多糖得率影响显著，而浸泡时间对仙茅总多糖得率影响很小。经过均匀设计试验回归统计分析优选仙茅粗多糖的最佳提取工艺为：提取温度为100℃，液固比为10 ∶1（mL/g），提取时间为 30 min，仙茅总多糖得率为6.18%。

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