孔桂菊，杜鸿志，袁胜涛，孙 立

(中国药科大学 江苏省新药筛选中心，江苏 南京 210009)



金花茶正丁醇提取物对乌拉坦诱导小鼠肺癌作用研究

孔桂菊，杜鸿志，袁胜涛*，孙 立*

(中国药科大学 江苏省新药筛选中心，江苏 南京 210009)

目的：研究金花茶正丁醇提取物对乌拉坦诱导小鼠肺癌模型肿瘤发生的作用。方法：以乌拉坦(800mg/kg)每周2次，连续5周腹腔注射诱导小鼠肺癌模型，金花茶正丁醇提取物连续灌胃14周。检测肺癌发生率，小鼠血清和肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、白细胞介素-2(IL-2)与肿瘤坏死因子(TNF-α)变化。结果：金花茶正丁醇提取物使乌拉坦诱导肺癌的发生率降为75.0%，模型组为90.5%；正丁醇组与模型组相比，血清中SOD、CAT、IL-2、TNF-α含量上升，组织中SOD、CAT含量显著升高，血清与组织中MDA下降无显著性差异。结论：金花茶正丁醇提取物对乌拉坦诱导的小鼠肺癌有预防作用，主要机制可能与其抗氧化和免疫调节作用有关。

金花茶；乌拉坦；肺癌

金花茶是国家一级重点珍稀保护植物，被誉为“植物界的大熊猫”，现在已经有很多人关注与研究金花茶的栽培育种，以使其发挥更好的观赏价值与其他应用价值。金花茶富含400多种对人体有益的营养及药用成分，目前对金花茶抗肿瘤的研究正在进行中，很多报道表明[1-2]金花茶对体外前列腺癌、胃癌、鼻咽癌、食管鳞癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等细胞具有很好的生长抑制作用，其作用机制大多报道为诱导细胞凋亡。关于金花茶提取物对体内肿瘤的抑制作用还未见报道，本文首次通过实验验证金花茶正丁醇提取物是否具有防癌效果，观察金花茶正丁醇提取物对乌拉坦诱导小鼠肺癌的作用，并进一步探讨金花茶正丁醇提取物防癌作用的机制，为金花茶“药食两用”的开发提供有力的科学依据。

1 材料

1.1 实验动物

昆明小鼠，雌性，体重18～22g，SPF级，购于上海杰思捷实验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK(沪)2012-0006，实验动物质量合格证号0140158。

1.2 药品与试剂

金花茶正丁醇部位由南京理工大学贾爱群教授实验室提供；乌拉坦(Urethane，94300)购于瑞士Sigrna-alrich公司；超氧化物歧化酶(superoxde dismutas，SOD)测定试剂盒、过氧化氢酶(catalase，CAT)测定试剂盒及丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；白细胞介素-2(IL-2)及肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA试剂盒购于上海裕臣生物科技有限公司。

2 方法

2.1 药品与试剂配制

乌拉坦临用前用生理盐水配制，浓度为80mg/mL。金花茶正丁醇提取部位药物用0.5%的CMCNa配置成10mg/mL。

2.2 模型建立与分组给药

KM小鼠随机分为3组，正常对照组、模型组、金花茶正丁醇提取物组(简称正丁醇组)分别有15、25、15只。模型组、正丁醇组小鼠腹腔注射乌拉坦800mg/kg，每周2次，连续5周，在造模的同时正丁醇组灌胃给予金花茶正丁醇提取物100mg/kg/d，连续14周，第15周实验结束。

生：我是假设左边三角形的底是a，右边三角形的底是b，那么阴影部分的面积就是a×8÷2+b×8÷2，我们知道可以利用乘法分配律a×8÷2+b×8÷2=（a+b）×8÷2，而a+b=12，所以三角形的面积是12×8÷2=48（平方厘米）。

2.3 取材和观察指标

收集血样及心、肝、脾、肺、肾、胸腺等内脏。准确称取肝脏、脾脏、肺与胸腺的重量，计算脏器系数。记录肺部肿瘤结节数。随机选取每组4只小鼠的肺脏做HE染色。检测血清与组织中SOD、CAT、MDA、IL-2及TNF-α。具体应用方法参照试剂盒说明书。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 金花茶正丁醇提取物对肺癌小鼠体重的影响

对照组小鼠体重在第1、2、3周增长较快，4～14周稳步增长。模型组、正丁醇组小鼠体重在造模并给予药物的同时稳步增长，在6～14周也无明显差异。仅在第2、3、4周正丁醇组体重与对照组具有显著性差异，结果见图1。

图1 金花茶正丁醇提取物对肺癌小鼠体重的影响

3.2 金花茶正丁醇提取物对肺癌小鼠脏器系数的影响

各组脏器经过称重发现，模型组与对照组相比脾脏重量降低且具有显著性差异，其他各组间均无显著性差异。各组的脾脏脏器系数为：模型组<正丁醇<对照组。表1中可以发现模型组与对照组相比，肝脏增大，脾脏减小，胸腺增大，肺增大；正丁醇组与对照比胸腺基本无变化，脾脏稍有减小，肝脏略减小，肺基本无变化。

表1 金花茶正丁醇提取物对肺癌小鼠脏器系数的影响 (±s)

注：***P<0.001。

对照组正常肺呈淡粉色，表面光滑，无突出物。患肺癌小鼠肺部整体呈淡粉色，上面有很多白色圆形结节点，略突出于肺表面。在第9、10、14周时取部分模型组小鼠解剖，查看肺肿瘤形成情况，肺结节在第9周已经可见，第14周时可见较大的肺结节，见图2。实验结束，对照组无小鼠发生肺肿瘤，模型组肺肿瘤发生率为90.5%，金花茶正丁醇提取物组肺肿瘤发生率为75.0%。金花茶正丁醇提取物组左右肺平均结节数均小于模型组。

3.4 金花茶对肺组织HE染色的影响

实验结束，每组选择4只进行HE染色，结果为对照组正常肺组织由肺泡及肺内支气管组成，结构清晰，肺泡壁轻度充血，无肿瘤细胞(见图3对照组)。模型组4只小鼠肺内出现肿瘤或肿瘤性增生病灶(出现率100%)。模型组肿瘤细胞体积大，略呈柱状或多边形，细胞核大、深染、核仁大而明显，核分裂现象易见，肺柱状其它部位中度出血(见图3模型组)，还有2只出现炎细胞浸润。正丁醇组中4只小鼠无肿瘤或肿瘤增生性病灶(出现率0%)，肺泡壁轻度充血、水肿(见图3正丁醇组)，有轻度炎细胞浸润，炎细胞类型主要为中性粒细胞和单核巨噬细胞。

表2 金花茶正丁醇提取物对小鼠肺肿瘤发生的影响 (±s)

3.5 金花茶正丁醇提取物对肺癌小鼠的生化指标影响

在血清检测中，模型组小鼠相对于正常对照组CAT、SOD、IL-2、TNF-α降低，MDA升高，无显著性差异。正丁醇组相对于模型组，使乌拉坦诱导小鼠肺癌血清CAT、SOD、IL-2、TNF-α的含量升高，MDA含量下降，但无显著性差异。在肺组织检测中，模型组小鼠相对于正常对照组CAT、SOD含量降低，MDA含量升高，无显著性差异。正丁醇组相对于模型组，使乌拉坦诱导小鼠肺癌组织CAT、SOD含量显著升高，使MDA含量降低但无显著性差异。

图2 乌拉坦致肺癌变化情况

图3 金花茶正丁醇提取物对乌拉坦致肺癌小鼠肺组织HE染色结果(HE，×200)

4 讨论

小鼠肺癌模型建立的方法较多，乌拉坦是一种较好的致肺部肿瘤药物[3]，采用昆明小鼠是因为其致癌比较敏感[4]，采用多次腹腔注射可以提高致癌率[5]，本实验在给药14周后已经造模成功，模型组成瘤率为90.5%。小鼠体重在造模初期与对照组相比会有差异，但是整个造模过程体重变化与对照组基本一致，这与文献报道乌拉坦不会影响小鼠体重相符[6]。我们诱导小鼠肺癌模型，研究金花茶正丁醇提取物对肺肿瘤发生的影响，发现金花茶正丁醇提取物可以降低肿瘤发生率，使肿瘤数目减少，表明金花茶正丁醇提取物具有预防肿瘤发生及抑制肿瘤生长的作用。通过HE染色证明模型组肺肿瘤形成，金花茶正丁醇提取物具有预防肺肿瘤作用。金花茶正丁醇提取物对肺癌的抑制率不是很高，可能是该提取物很难逆转乌拉坦致肺癌的效果。另外金花茶正丁醇提取物可能对不同癌症模型效果不同，研究表明金花茶正丁醇提取物对肠癌抑制效果很好，今后我们会多考虑不同药物诱癌并增多癌症模型进一步深入研究验证金花茶的抗癌效果。

表3 金花茶正丁醇提取物对小鼠血清中MDA、SOD、CAT、IL-2、TNF-α含量的影响 (±s)

表4 金花茶正丁醇提取物对小鼠肺癌组织中MDA、SOD、CAT含量的影响 (±s)

注：*P<0.05 vs 模型组，***P<0.001 vs 模型组。

SOD、CAT属于体内消除自由基的酶类，它们与体内其他抗氧化剂组成一个自由基的防御系统，以清除过多的自由基，防止自由基诱癌、促癌、致癌。MDA为反应机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞的损伤程度及受自由基攻击的严重程度。文献报道[7-10]金花茶提取物具有很好的抗氧化与清除自由基能力。本实验结果显示，金花茶正丁醇提取物使小鼠肺癌组织中SOD、CAT的含量显著增加，使MDA含量降低，我们推测金花茶预防肺癌的效果与其抗氧化作用相关。

IL-2与反应细胞的IL-2受体结合后，可诱导TH、TC细胞增殖；激活B细胞产生抗体，活化巨噬细胞；增强NK细胞和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞的活性，诱导干扰素的产生[11]。干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。TNF-α主要由活化的单核/巨噬细胞产生，能杀伤和抑制肿瘤细胞，促进中性粒细胞吞噬。在本研究中金花茶提取物升高小鼠血清中的IL-2与TNF-α含量，但是效果不明显。脾脏为免疫器官，模型组中脾脏减小而给药金花茶正丁醇提取物后与对照组无差异。金花茶提取物的防癌抗癌作用是否与免疫调节相关需要进一步验证。

本文首次通过实验验证金花茶正丁醇提取物确实具有预防乌拉坦诱导肺癌发生的作用，金花茶作为中药预防肿瘤发生效果可观，将其作为预防肿瘤的药物开发具有深远影响，我们今后将对其分子作用机制及对其他肿瘤的抑制效果进行深入研究，为开发药物提供参考。

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(责任编辑：余 婷)

Study Effect of Extrative Fraction of Camellia chrysantha(Hu) Tuyama from n-butyl alcohol on Lung Carcinogenesis Induced by Urethane

Kong Guiju,Du Hongzhi，Yuan Shengtao*,Sun Li*

(Jiangsu Center for New Drug Screening,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

Objective:To study the effect of extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol on lung carcinogenesis induced by urethane.Methods:The mouse lung carcinoma model was induced by intraperitioneal urethane 800 mg/kg twice a week for five weeks. The animals were treated with extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol for 14 weeks to investigate the rate of tumor incidence.The change of SOD,CAT,MDA,IL-2 and TNF-α in serum and in lung homogenate were tested.Results:Extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol could make urethane induced lung cancer incidence reduced to 75%,the model group was 90.5%;in N-butyl alcohol group compared with model group,the serum SOD,CAT,IL-2 and TNF-α levels rose,the content of SOD and CAT in lung homogenate increased significantly,the MDA in serum and tissue was down and there was no significant difference.Conclusion:Extrative fraction from Camellia chrysantha Tuyama from n-butyl alcohol can prevent lung carcinogenesis induced by urethane,which might be related to its antioxidantion and immune-regulation.

Camellia Chrysantha Tuyama;Urethane;Lung Cancer

2015-06-10

国家高技术研究发展计划(863计划，2014AA022208)

孔桂菊(1990-)，女，中国药科大学硕士研究生，研究方向为肿瘤药理学。

通讯简介：袁胜涛(1967-)，男，博士，中国药科大学教授、博士生导师，研究方向为肿瘤药理学；孙立(1976-)，女，博士，中国药科大学副教授、硕士生导师，研究方向为肿瘤药理学。

R285.5

A

1673-2197(2015)21-0004-03

10.11954/ytctyy.201521002