王雪梅，李新凤，路平，王建明

（山西农业大学 农学院，山西 太谷030801）

玉米丝黑穗病，俗称“乌米”，是世界各国玉米生产上的重要病害之一［1］。20世纪70年代初丝黑穗病已经成为我国春玉米产区的重要病害，严重威胁着玉米的可持续生产［2，3］。该病由孢堆黑粉菌（Sporisorium reilianum）侵染引起，是一种苗期侵染成株期发病的系统侵染性病害。目前生产上还缺乏对该病菌的早期准确检测措施，而且对玉米丝黑穗病的抗性鉴定也主要采取田间致病性回接试验，既费时又费力。开发有效的分子标记，从分子水平上研究孢堆黑粉菌的不同致病型遗传差异，建立快速准确的玉米丝黑穗病菌室内分子检测的体系，为该病害的早期准确诊断、抗病育种及病害防治提供了理论与实践基础。

SSR（简单重复序列，simple sequence repeat）是由1～6个核苷酸重复单元串联排列而成的核苷酸序列，广泛分布于生物基因组内［4，5］。根据不同物种DNA序列中微卫星基元种类与长度差异所产生的多态性而建立的分子标记技术，即SSR（simple sequence repeat，microsatellite）标记，可以快速、有效地分析物种的遗传差异［6，7］。和其它分子标记技术相比，该技术具有多态性高、共显性遗传、技术简单、丰富且遍布基因组等特点［8～11］。目前已广泛应用于基因精细定位［12，13］、种群遗传多样性分析和系谱比较等研究中［14～16］。SSR标记开发方法主要有微卫星富集法、省略筛库法、构建和筛选基因组文库法和搜索数据库法等［17］，其中最经济便捷的方法就是数据库搜索法，且随着生物基因组测序的迅速发展，基于物种全基因组序列开发SSR标记已经成为开发物种SSR标记的一种重要方法。

随着玉米丝黑穗病菌全基因组测序的完成，基因库中已释放23条染色体基因组序列，本文利用生物信息学方法搜索玉米丝黑穗病菌基因组第4、5、6、7条染色体序列中的SSR位点，分析其分布规律与组成特点，并在此基础上进行SSR引物的设计，为开发丝黑穗病菌基因组SSR标记及相关领域的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

自 NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）数据库中搜索孢堆黑粉菌（Sporisorium reilianum）的基因组序列，并以FASTA格式下载孢堆黑粉菌的23条染色体基因组序列，选取其中4条染色体即第4、5、6、7条染色体对其进行分析。

1.2 孢堆黑粉菌基因组SSR的检索与信息分析

利 用 在 线 软 件 SSRIT （http：／／www.gramene.org／db／markers／ssrt001）并结合人工搜索对孢堆黑粉菌基因组第4、5、6、7条染色体序列中的SSR位点进行搜索，选择含有2～6碱基且重复基元长度≥18bp的基因组序列（二核苷酸重复次数≥9，三核苷酸重复次数≥6，四核苷酸重复次数≥5，五核苷酸重复次数≥4，六核苷酸重复次数≥4），然后在此基础上统计SSR序列出现频率与长度，并分析其组成与分布特点。SSR出现频率fc＝c／n×100%，c为基元类型的重复次数，n为无冗余SSR数量。

1.3 基因组SSR引物设计

基于孢堆黑粉菌基因组SSR位点（包含其前后两端各截取的300bp左右序列），利用在线软件Primer 3.0对符合条件的SSR序列进行引物设计，引物设计主要参数如下：退火温度（Tm）为55～65℃，上下游引物的退火温度相差小于2℃；GC含量在40%～60%；引物长度为18～25bp之间；预期PCR扩增产物长度为100～500bp之间。

2 结果与分析

2.1 孢堆黑粉菌基因组SSR信息分析

2.1.1 孢堆黑粉菌SSR的出现频率

通过对孢堆黑粉菌基因组第4、5、6、7条染色体进行分析（如表1），共搜索到317个SSR位点，序列总长度为6.89kb，占四条染色体基因组碱基数的0.21%，平均每条染色体大约含有79个SSR，每10.3kb中就有一个长度不小于18bp的SSR序列。此外，各条染色体中SSR数存在明显差异，在第4和第7条染色体中，三核苷酸重复类型最高，二核苷酸次之；而在第5条染色体中，三核苷酸最多，四核苷酸次之；在第6条染色体中，三核苷酸最多，四、五核苷酸次之。总的来说，这4条染色体中，三核苷酸重复类型的SSR数最多。

由表2可以看出，在检索到的孢堆黑粉菌SSR中，二至六核苷酸重复类型均存在，但出现数量和频率存在明显差异。其中三核苷酸重复类型出现频率最高，共171个，占总SSR的53.94%，出现频率达2.42%。其它各类核苷酸重复类型的出现频率均小于1.00%。

2.1.2 孢堆黑粉菌SSR重复基元组成与分布

通过对孢堆黑粉菌SSR中重复基元类型与分布特点进行分析，结果如表3所示。从表3可以看出，二核苷酸重复类型中，主要的重复基元类型为（GA／TC）n，共有20个，占全部 SSR 的比例为39.22%，其次为（AG／CT）n，共有18个（35.29%），其余各重复基序类型的数量都小于10个；三核苷酸重复类型中，出现最多的重复基序类型为（GCA／TGC）n、（AGC／GCT）n和（CAG／CTG）n，分别为42个（24.56%）、27个（15.79%）和26个（15.20%），其余各重复基序的数量均小于20个；在四、五、六核苷酸重复类型中，除（ACGC／GCGT）n和（GCCA）n，其余各重复基序类型占所有SSR的比例均小于10%。可见，每种重复基元的出现频率各不相同，出现频率最高的重复基序类型为（GCA／TGC）n，高达13.25%，其次是（AGC／GCT）n和（CAG／CTG）n，分别为8.52%、8.20%。其他各类重复基元的出现频率均在0.3%～6.5%之间。

表1 孢堆黑粉菌不同染色体的SSR数量分布表Table 1 The distribution sheet of SSR number in different chromosomes of Sporisorium reilianum

表2 孢堆黑粉菌基因组SSR数量与比例Table 2 Number and percentage of SSR inSporisorium reilianum

表3 孢堆黑粉菌中SSR主要重复基元类型及比例Table 3 The motifs and their percentages inSporisorium reilianumSSRs

续表3

2.1.3 孢堆黑粉菌基因组SSR中基元重复次数和长度

孢堆黑粉菌SSR中基元重复次数的分析结果见表4。由表中可以看出，以重复基元的最低重复次数为4的标准对孢堆黑粉菌基因组SSR进行检索，共获得15种重复次数，其中重复基元的最高重复次数为23次。重复次数为6次时获得的SSR数量最多，占SSR总数的26.18%，其次为7次重复，占SSR总数的18.30%。其中三核甘酸重复序列的重复次数最多（23次）；其次是二核苷酸重复序列（22次），五核苷酸重复次数最少，只有8次。此外，由表4还可以得出，在孢堆黑粉菌基因组的这4条染色体中，共搜索到317个SSR位点，其中三核苷酸重复序列出现频率最高，共171个，其次为二核甘酸重复序列，数量为51个，这两种SSR共计222个，占SSR总数的70.03%；六核甘酸重复最少为17个，四核苷酸和五核苷酸重复序列数量相差不大。

2.2 孢堆黑粉菌基因组SSR引物设计

基于孢堆黑粉菌基因组序列，利用Primer3.0在线软件共设计SSR引物40对。引物信息见表5。S之前的数字表示染色体编号，之后的数字表示引物设计序号。

表4 孢堆黑粉菌基因组中SSR组成与频率分布Table 4 Number of repeat occurred in Genomic－SSR of Sporisorium reilianum

表5 孢堆黑粉菌基因组SSR引物信息Table 5 Characteristics of Genomic－SSR primers designed forSporisorium reilianum

续表5

续表5

3 结论与讨论

通过对孢堆黑粉菌第4、5、6、7条染色体基因组进行SSR信息分析，在一定程度上反映了该病菌基因组中SSR的组成、分布与密度，并在此基础上设计SSR引物，结果表明，SSR位点占这4条染色体基因组总长的0.21%，平均10.3kb中就分布有一个长度大于18bp的SSR序列。其次该SSR分布具有短重复核苷酸基序更为丰富的特点，三核苷酸重复和二核苷酸重复占绝对优势；而长重复核苷酸基序的数量比短重复核苷酸基序的数量少，尤以六核苷酸重复的数量最少。这一结果为开发孢堆黑粉菌SSR引物及进行玉米丝黑穗病菌遗传学研究提供了可靠的理论依据。

在禾谷镰刀菌基因组中，SSR序列占基因组全长的0.27%，平均7.7kb碱基中有一个大于15 bp的SSR序列，而且长重复碱基基序更为丰富，数量最多的是五碱基重复序列，其次是六碱基重复序列，而数量最少的则是二核苷酸重复序列；［12］而在稻瘟病菌基因组中，SSR序列约占整个基因组全长的0.85%，平均2.36kb碱基中就分布有1个SSR序列，数量最多的是单碱基重复序列，其次为三碱基重复序列和五碱基重复序列。［12］由此可见，在不同真菌中其SSR组成存在着很大的差异。造成这种差异的原因可能有两种：其一，可能是不同研究人员对SSR最低长度标准等参数的设置不同，或数据库中的染色体基因组数量差异造成。其二，可能是由于物种的真实SSR信息差异所致。

近年来，随着基因组测序的迅速发展，越来越多的物种全基因序列被释放出来，使得人们基于物种的全基因组序列开发SSR标记成为可能。Suga H、Naef A、Saharana M S、Scott J B等基于Fusarium graminearum基因组DNA（gDNA）开发了46对可用于禾谷镰刀菌种内、近缘种间或引起赤霉病的几种镰刀菌间遗传多样性分析的SSR引物［18～21］。国内任旭等［22］基于 Fusarium verticillioides基因组DNA开发了22对可用于轮枝镰刀菌遗传多样性分析的引物。徐静静等［23］基于大豆疫霉菌基因组开发了12对可用于大豆疫霉菌遗传多样性分析的SSR 引物。目前，NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）数据库中，已经公布了玉米丝黑穗病菌23条染色体基因组序列，但未见有关该病菌Genomic－SSR标记开发及其应用方面的报道，因此玉米丝黑穗病菌Genomic－SSR标记还有很大的挖掘潜力。

本研究基于玉米丝黑穗病菌的全基因组序列，利用生物信息学技术，对其基因组SSR序列进行搜索和分析，在此基础上开发Genomic－SSR引物，为进一步建立玉米丝黑穗病菌Genomic－SSR标记和探索其在玉米丝黑穗病菌基因组学研究中的应用奠定了理论基础。

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