郑晓吉，史学伟，许程剑，董 娟，倪永清*

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832003）

酵母菌作为一类重要的微生物资源，在食品、医药、发酵工业、环保等行业被广泛应用。研究发现，酵母菌的营养代谢极其多样，在自然界不同的微环境中能够利用不同的底物，展现出极强的生存能力，甚至进化出比细菌更好的适应低温环境的能力[1]。无论在南极、北极还是一些低纬度高海拔山地冰川的冰芯、冻土、融水和沉积物等各种冰冻圈环境中均有可培养酵母菌存在，而且发现栖息于低温生态系统的酵母菌为一些特定的种属[2]。近年来发现，嗜冷酵母菌的代谢产物（如低温酶、胞外多糖、多聚不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、γ-癸内酯等）在食品、药物开发以及现代生物降解工程中应用潜力巨大，使得嗜冷酵母菌资源逐渐引起人们的关注，正在成为一个新的研究热点[1-4]。由于全球气候逐渐变暖，冰川持续退缩，嗜冷微生物的生存环境不断遭到破坏，开发和认识这些低温微生物迫在眉睫。

果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称，可分为两大类：解聚酶和果胶酯酶。果胶酶主要应用于果汁提取、果汁澄清、果酒澄清与过滤、果实脱皮、纺织工业麻类（亚麻、苎麻）脱胶、畜牧业的饲料添加剂及中药营养液的深加工等。冷适应果胶酶具有低温条件下高活性的优点，应用在果汁澄清等方面防止果汁营养成分破坏，此外，低温条件下保护食品热敏性物质不被破坏、防止微生物污染。

天山乌鲁木齐河源一号冰川是我国在冰川水文、气候变化、生态退缩等基础研究方面最为详尽的冰川。本研究从天山一号冰川底部沉积层空水及融水中分离筛选耐低温酵母菌菌株，通过分子生物学方法揭示菌株的物种多样性、系统进化关系，了解其生态生理及产胞外酶特征，以期为后续研究开发低温酵母菌的生物技术利用潜力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 主要试剂

用于PCR 扩增的全套试剂及扩增引物：宝生物工程大连（TaKaRa）有限公司；PCR 产物纯化试剂盒：加拿大Bio Basic Inc.公司；相关生理生化试验所用试剂购自天津市巴斯夫化学试剂厂及天津市致远化学试剂厂。

1.1.2 培养基

分离培养基采用孟加拉红（rose Bengal，RB）培养基：琼脂15 g/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，氯霉素0.1 g/L，氯硝胺（dichloran）溶液1 mL/L；孟加拉红溶液0.5 mL/L，pH值调至5.6。

基础培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培养基：麦芽浸膏30 g/L，蛋白胨0.5 g/L，琼脂15 g/L，pH值调至5.6。

产果胶酶培养基：果胶10 g/L；酵母提取物10 g/L；蛋白胨20 g/L；葡萄糖20 g/L；琼脂20 g/L，pH值调至7.0。

1.2 仪器与设备

Fresco21高速冷冻离心机：美国Thermo公司；Tprofessional PCR仪：德国Biometra公司；Gel DOC XR凝胶成像系统、170-8720 icycler定量基因扩增仪：美国Bio Rad 公司；ABI377 DNA自动测序仪：上海生工生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

（1）低温土样采集

冻土样品采自天山一号冰川北侧的空冰斗地区多年冻土层，海拔3 833 m以上区域（43°07.125N，86°48.707E）（年平均地温为-4.95 ℃），采集低温土样。沿33 m深的冻土剖面每隔20 cm取样，然后将冻土样品迅速装入己灭菌的土壤盒内，置于车载冰箱中保存。运回实验室后，在超净工作台上削去表层可能受到污染的样品，于-20 ℃保存备用，用标准pH计测定土壤浸出液pH值。

（2）冰川融水样品

从乌鲁木齐河源天山一号冰川站，海拔3 250 m以上区域（年平均地温为-4.95 ℃）的高寒环境中采集冰川流动和沉积两种融水，温度分别为1.0 ℃和1.5 ℃，将水样迅速装入己灭菌的广口瓶内，置于车载冰箱中保存。运回实验室后立即过滤并富集融水中微生物，过滤液于4 ℃保存备用。以上所有过程均在无菌条件下完成。

1.3.2 菌株的分离和保藏

菌株分离采用酵母菌基础培养基[6]和分离培养基[7]。菌株分离方法：在超净工作台上用孔径为0.22 μm的滤膜过滤水样，收集滤膜上的菌体。采用梯度稀释平板涂布法分离水样品中的可培养酵母。15 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，待菌落长出后，根据菌落颜色、大小、形态等表型差异进行初步分离，转接划线后，将所得纯培养物转接到YEPD斜面培养基中4 ℃备用。已纯化菌株保存于装有20%灭菌甘油管的保藏管中，并存于-70 ℃冰箱保藏。

1.3.3 产果胶酶酵母菌的筛选[8]

在筛选培养基上培养分离纯化的低温菌株，16 ℃培养3 d后在培养基表面分别滴加刚果红溶液（1 mg/mL）染色10～15 min，再用NaCl（1 mol/L）溶液清洗，观察菌落周围是否有透明圈产生。

1.3.4 低温酵母菌形态学和生理生化特性鉴定

（1）酵母菌形态特征

根据酵母菌分类学鉴定标准方法对供试菌株进行鉴定[9]。

（2）最适生长温度的确定

将活化的酵母菌种以0.5 mL的接入量接入装有5 mL的YEPD（pH 5.6）液体富集培养基中，分别在4 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃及25 ℃的5个温度梯度的培养箱中培养24 h后，波长420 nm处测光密度值OD420nm。

1.3.5 PCR扩增及测序

（1）总DNA提取

用MAKIMURA K等[10]的方法提取菌株总DNA。

（2）PCR扩增26S rDNA D1/D2区基因[11-12]

采用酵母菌通用引物NL1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′）和NL4（5'-TCC TCC GTC TAT TGA TAT GC-3′）对26S rDNA D1/D2区基因片段进行PCR扩增。扩增条件[13]：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，36个循环，72 ℃延伸10 min。反应在icycler定量基因扩增仪上进行。1.2%琼脂糖凝胶电泳确认扩增效果和片段大小。

PCR 产物用EZ-10柱纯化后，由ABI377 DNA自动测序仪直接测序。

2 结果与分析

2.1 产果胶酶酵母菌筛选及产酶菌株形态特征

培养基筛选结果表明：68株菌株中4株菌株能在以果胶为底物培养基中产生明显的透明圈，结果如图1所示。编号分别为C2、C9、L1、L13，初步判断这几株酵母菌产果胶酶。

图1 菌株产酶透明圈Fig.1 Transparent circle of pectinase-producing strains

由图1初步判断这几株低温酵母菌能产果胶酶，其生长特性与形态特性见表1。

由表1可知，培养48 h后，麦芽浸膏培养基上形成颜色和形态有所不同的酵母菌。C2菌株：乳白色、中央隆起、边缘规则、不易于挑起的直径约2～3 mm的奶油状菌落、表面光泽、培养时间3～5 d，菌落没有明显变大。C9菌株：白色、中央隆起、边缘较规则、易于挑起的直径约2～3 mm的奶油状菌落、表面无光泽、培养时间延长至3～5 d，菌落直径可达到4 mm。L1菌株：乳白色、中央隆起、边缘规则、不易于挑起的直径约1～2 mm的奶油状菌落、表面光泽、培养时间3～5 d，菌落没有明显变大。L13菌株：浅橘黄色、中央隆起、边缘规则、不易于挑起的直径约4～5 mm的奶油状菌落、表面光泽、培养时间3～5 d后，菌落变大但不是很明显。

表1 低温酵母菌株的生长特性与形态特性Table 1 Growth characteristics and morphological characteristics of psychrophilic yeast

2.2 26S rDNA基因序列同源性分析

将提取的基因组DNA以NLl和NL4通用引物特异扩增酵母菌的26S rDNA电泳结果见图2。

图2 PCR 扩增产物电泳检测图Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplification product

据Marker相对分子质量大小显示，四株菌的26S rDNA基因D1/D2区目片段大小约550～600 bp，由图2可知，扩增产物均为单一条带无非特异扩增现象，并且试验菌株均符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株间差异不超过1%的标注。

2.3 产果胶酶酵母菌系统发育分析

PCR产物纯化后直接由上海基康生物工程有限公司用ABI3700基因测序仪进行测序。将4株酵母菌株所获得的26S rDNA D1/D2区域序列提交美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI），通过Blast工具在GenBank数据库中与已发表的26S rDNA D1/D2区域序列进行同源性比较，构建系统发育树，结果见图3和表2。

由图3、表2可知，C2菌株与（Cryptococcus maceransDQ377662）亲缘关系最近，序列同源性均为99%，形成一个簇群，结合C2菌株的形态学特征、培养特征、生理生化特征、26S rDNA序列分析，将该菌鉴定为隐球酵母属；C9菌株与（Cryptococcussp.DQ377668）亲缘关系最近，序列同源性均为99%，形成一个簇群，结合C9菌株的形态学特征、培养特征、生理生化特征、26S rDNA序列分析，将该菌鉴定为隐球酵母属；L1菌株与（Rhodotorula laryngisJQ768911）亲缘关系最近，序列同源性均为99%，形成一个簇群，结合L1菌株的形态学特征、培养特征、生理生化特征、26S rDNA序列分析，将该菌鉴定为红酵母属；L13菌株与（Rhodotorulasp.JX124722）亲缘关系最近，序列同源性均为98%，形成一个簇群，结合L13菌株的形态学特征、培养特征、生理生化特征、26S rDNA序列分析，将该菌鉴定为红酵母属。

图3 基于26S rDNA序列的酵母菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of yeast strain based on 26S rDNA regional sequence

表2 分离菌株依据26S D1/D2序列鉴定结果Table 2 Identification results based on 26S rDNA regional sequence

3 结论

本研究通过对天山乌鲁木齐河源一号冰川融水可培养酵母菌的分离和筛选，了解冰川低温酵母菌的生长特性、系统发育多样性和冰川低温微生物物种多样性。实验中所筛得的酵母菌株能够代表低温微生物的生理特性，其最适生长温度较低，属于耐冷菌范畴。分离的产酶菌株生长范围较宽，也能够在较高的温度下正常生长，可能是常温菌在低温条件下长期进化的结果。尽管科学家们已经从低温微生物中分离纯化了多种低温酶，但国内目前对于产低温酶菌株及其所产低温酶的酶学性质开展的基础性研究却很少，而且仅仅依据可培养菌株的26S rRNA基因测序技术并不能反应产酶微生物的多样性，只有通过产酶分析，才能真正了解产酶菌株的生物多样性，筛选出优质高效的产酶菌种，为产低温酶生物技术的应用奠定理论基础。

本研究从冰川冻土样品共分离得到68株低温酵母，待测菌株与GenBank数据库中菌株的比对发现隶属于7个属（1个子囊菌属和6个担子菌属），隐球酵母属（Cryptococcus）是一种机会致病性真菌，在本次所筛选的菌株中占到总数的40%，产低温酶的比例最大，这一结果与其他地区分离出低温酵母菌的优势菌种相一致[14]；其次是红酵母菌属（Rhodotorula）和掷孢酵母属（Sporobolomyces）。26S rDNA 5′末端有一个长约600 bp 的D1/D2序列，对核苷酸序列可变区D2的多态性分析，发现这一区域在同种间的该区域核苷酸的差异＜1%，而不同种之间的差异通常远远大于这个数据，虽然同一系统发育类群的菌株其26S rDNA序列相似性很高，还应该结合表型特征以及更精确的分子指纹技术来区分和筛选高效产酶菌株。KIM J K等[15]的研究指出，使用萃取法从冬孢酵母属（Rhodosporidiumsp.）中提取β-胡萝卜素，对提取色素及类胡萝卜素等营养素将会有进一步的开发研究，未来可能会运用到实际生产中。

本研究对冰川中可培养酵母菌进行了分离筛选，了解了冰川中低温酵母菌的生长特性、系统发育和物种多样性，并对其能否产果胶酶进行了验证，在后续实验中会对低温酵母菌的产酶活性进行实验验证与拓展，以及使用宏基因组学对冰川中低温酵母菌的总DNA建立克隆文库，以期更加准确的了解极端环境中酵母菌的系统进化地位。

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