韩晓勇　宋婷婷　王立　等

摘要：以靖江香沙芋茎尖为外植体进行快速繁殖技术研究。结果表明，75%乙醇浸泡30 s和84消毒液消毒10～15 min配合使用灭菌效果最好；芽诱导最适培养基为MS+0.5 mg/L TDZ，培养25 d后芽诱导率最高，为80%，芽高度为2.3 cm；继代增殖最适培养基为MS+1.0 mg/L TDZ，月增殖倍数可达4.3；生根培养最适培养基为1/2MS+01 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.02%活性炭，平均生根时间为11 d，生根率达100%，根系最长为2.9 cm；生根培养45 d，将试管苗移入营养土中生长，30 d后移栽成活率达100%。

关键词：靖江香沙芋；组织培养；芽诱导；快繁

中图分类号： S632.304+.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0050-03

收稿日期：2014-03-03

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（12）2008]。

作者简介：韩晓勇（1983—），男，山西忻州人，硕士，助理研究员，从事特色经济作物组织培养技术研究。E-mail：hanxy84@163.com。

通信作者：殷剑美，博士，研究员，主要从事特色经济作物研究。Tel：（025）84390860；E-mail：yinjm2006@sohu.com。靖江香沙芋属天南星科（Araceae）芋属（Colocasia） 多子芋类型，是靖江市农民栽培的芋类作物当家品种。其块茎中淀粉含量高，既可以当粮食，又可做蔬菜，是老幼皆宜的滋补品，并含有多种维生素，有一股独特的香味。加工前景广阔，闻名并畅销广西、广东及港、澳地区。靖江香沙芋通常采用母芋留种方式进行繁殖，种性退化问题较为突出，抗病性和抗逆性减退。建立靖江香沙芋组培再生体系，不仅有利于品种的更新复壮，更可为种苗工厂化生产和新品种选育提供技术支持与储备。

近年来，芋组织培养已相继开展，对其茎尖和叶片等不同外植体培养进行了广泛的研究[1-5]。但这些研究主要围绕外植体愈伤诱导及植株再生，而愈伤诱导过程中易发生变异，不利于保持本品种的优良特性。本研究旨在建立一种从芽直接到多芽体，多芽体到试管苗的繁殖方式。这种繁殖方式不仅可以提高繁殖系数和繁殖速度，而且利于保持本品种的优良特性，可有效保护具有地方特色的种质资源。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为靖江香沙芋芋茎尖。

1.2方法

1.2.1无菌材料的处理选取保存完好、无腐烂斑点的芋，经0.2%的K2MnO4消毒5 min后整齐排列在周转箱中，用沙子覆盖到整个芋块的2/3处，放置到光照培养箱中催芽。待芽生长到1～3 cm时切取茎尖，剥除外层2～3层叶片，流动水冲洗10 min，在超净台上用75%乙醇浸泡30 s，分别用NaClO、84 消毒液2种消毒剂，NaClO设10、15、20 min，84消毒液设5、10、15 min 3个时间段处理灭菌，每种处理分别接种12个茎尖于MS培养基中，观察灭菌效果。

1.2.2芽诱导分化外植体经灭菌后接种在添加不同浓度的6-BA和NAA及TDZ和IBA组合的MS培养基中，接种25 d后比较芽的分化率、芽高度及叶片数等确定适宜芽分化的培养基。激素浓度设置7个处理，每个处理设3次重复，每次重复接种15个茎尖。

1.2.3继代增殖诱导培养基上萌发出的不定芽长到2 cm左右时，切取单芽接种在添加不同浓度的6-BA和NAA及TDZ和IBA组合的MS培养基中，30 d时观察其增殖倍数。激素浓度设置6个处理，每个处理设3次重复，每次重复接种20个单芽。

1.2.4生根将高2.0 cm以上、带有2张或2张以上叶的健壮小苗切下，转入生根培养基中培养。生根基本培养基为1/2MS并添加0.02%活性炭。调查不同处理的平均生根时间，30 d的生根数、生根率、叶片数、根系平均长度及根系形态。生根培养基设置4个处理，每个处理设3次重复，每次重复接种15个小苗。

1.2.5炼苗与移栽生根培养45 d的再生苗在室外常温下放置5 d后，打开瓶盖炼苗1～2 d。将根系发达、株高5～12 cm 的再生苗从培养瓶中取出，洗去根部的培养基，移栽到营养土中，并置于相对湿度80%～90%、温度20～25 ℃的环境中遮阴培养1周，2周后正常光照培养，30 d时统计成活率。

1.2.6培养基灭菌及培养条件高压灭菌前调整培养基pH值为5.8，保持121 ℃灭菌20 min。培养室温度为（25±2） ℃，光照度2 000～3 000 lx，每天光照12 h。培养基中琼脂的质量分数为7 g/L，蔗糖质量分数为30 g/L。

2结果与分析

2.1不同消毒液和灭菌时间对外植体灭菌效果的影响

从表1可以看出，外植体用84消毒液灭菌10～15 min效果最好，灭菌成功率达83.3%以上。NaClO灭菌成功率远远低于84消毒液。

表1不同消毒液和灭菌时间对外植体灭菌效果的影响

消毒剂种类时间

（min）接种茎段数

（个）污染数

（个）污染率

（%）NaClO1012650.01512433.32012325.084消毒液512650.01012216.7151218.3

2.2芽诱导分化

从表2可以看出，MS+0.5 mg/L TDZ和MS+1.0 mg/L TDZ培养基芽诱导率及芽长势优于另外几种培养基。其中以MS+0.5 mg/L TDZ培养基芽诱导率最高，为80%，芽高度为2.3 cm（图1-A）。TDZ与6-BA 2种植物生长调节剂对芋芽诱导及生长的影响差异较大，与6-BA相比，TDZ对芽分化率及株高差异都达到显著水平，经25 d就能诱导茎尖长成2～3张叶。随着6-BA与NAA配比浓度的提高，芽分化率呈上升趋势，但株高及展开叶数呈下降趋势。当 6-BA ∶NAA=4.0 ∶0.2时，叶片容易发生卷曲。表2不同激素浓度和激素种类对芽诱导的影响

激素种类及浓度接种数

（个）分化数

（个）分化率

（%）株高

（cm）展开叶数

（张）植株表现6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L154c26.7c1.4c1b芽矮小6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L153c20.0c1.3c1b芽矮小6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L157b46.7b1.8b2ab芽矮小6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L157b46.7b1.4c1b叶片卷曲TDZ 0.5 mg/L+IBA 0.0 mg/L1512a80.0a2.3a3a正常TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.0 mg/L1511a73.3a2.3a3a正常TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.4 mg/L158b53.3b1.7b2ab芽粗短注：同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。表3、表4同。

2.3继代增殖

由表3 可以看出，诱导丛生芽增殖最适宜培养基为MS+1.0 mg/L TDZ，丛生芽分化速度快，增殖倍数可达4.3（图1-B），与其他处理差异显著。方差分析结果显示，TDZ对芽增效系数显著高于6-BA。随着6-BA与NAA配比浓度的提高，增殖系数呈先升后降的趋势。当6-BA ∶NAA=4.0 ∶0.2 时，增殖系数和芽均较小。

2.4生根培养

由表4可以看出，不同激素浓度对组培苗生根影响较大。其中激素浓度为6-BA ∶NAA=0.1 ∶0.5时生根效果最好，平均生根时间为11 d，生根率达100%，30 d的根系长度、叶片数以及株高均显著高于其他处理，分别为2.9 cm、3.5张和5.6 cm（图1-C）。随着NAA浓度增大，根系长度、叶片数和株高都有不同程度的下降，根系逐渐变短变粗，最终呈鸡爪

表3不同激素浓度和激素种类对芽增殖的影响

激素种类激素浓度

（mg/L）接种数

（个）芽数

（个）增殖系数生长描述6-BA/NAA1.5/0.22034e1.7e芽较小2.0/0.22042d2.1d芽较大4.0/0.22032e1.6e芽很小TDZ/IBA0.5/0.02078b3.9b正常1.0/0.02086a4.3a正常1.0/0.42075c3.75c易生根

状，并伴有少量气生根出现。组培苗培养45 d左右（图1-D）移入苗床营养土中，15 d后开始长出新叶，30 d时成活率达100%（图1-E）。

3讨论

TDZ（苯基噻二唑基脲）是一种人工合成的苯基脲重氮噻唑取代衍生物。Mok等首次发现TDZ有很强的细胞分裂素活性，浓度很低的TDZ能促进利马豆（lima bean）愈伤组织生长[6]。Chand等发现，在芋茎尖分生组织培养中，与BA相表4不同激素浓度对生根的影响

NAA

（mg/L）6-BA

（mg/L）接种数

（个）生根时间

（d）生根苗数

（苗）生根率

（%）平均根长

（cm）叶片数

（张）株高

（cm）植株表现0.50.1151115100a2.9a3.50a5.6a细长1.00.1151315100a1.7b2.80b3.4b粗短2.00.1151315100a1.2c2.25c2.8c鸡爪状，气生根4.00.1151315100a1.0c2.50bc2.9c鸡爪状，气生根

比，MS培养基中添加一定浓度的TDZ可以增强外植体的活力[7]。本试验结果表明，与6-BA相比，TDZ更适于促进芋茎尖萌动、生长及丛生芽增殖，与崔瑾等得出的TDZ在不同基因型芋组织培养的生理效应和TDZ对茎尖生长的影响结论[8-9]一致。适宜靖江香沙芋芽分化的培养基为MS+0.5～1.0 mg/L TDZ，其中以MS+0.5 mg/L TDZ的培养基芽诱导率和芽的高度方面表现最好；丛生芽增殖最适宜培养基为MS+1.0 mg/L TDZ，丛生芽分化速度快，增殖倍数可达4.3。林文丽等在海门香沙芋的组织培养中认为TDZ与IBA适当浓度配比有利于丛生芽的增殖[2]，本试验结果表明，添加IBA反而利于组培苗生根，形成差异的原因可能与品种的基因型有关。

在一定浓度范围内，提高NAA浓度有利于试管苗生根。但NAA浓度不能太高，当NAA浓度高于2.0 mg/L时，根系长度、叶片数和株高都出现不同程度的下降，说明高浓度NAA对试管苗的生长产生抑制作用，这种抑制作用随着NAA浓度的升高而越加明显[10]。外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响材料的培养。在培养基中加入0.02%的活性炭抗氧化吸附，并勤换培养基可以减少褐化[11]。

本研究中靖江香沙芋茎尖离体培养过程中产生丛芽但未见愈伤组织的产生，这种直接通过“芽生芽”的方式获得与亲本类似的幼苗，可以减少变异的可能，有效保护具有地方特色的种质资源，这与张晓兰等的观点[4]一致。

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