张瑞　雍晓雨　周俊　等

摘要：产甲烷菌在自然界中分布广泛，是一类重要的严格厌氧原核微生物，其参与的产甲烷作用通常发生在厌氧发酵过程的最后一步，可将无机物或有机化合物最终转化成甲烷和二氧化碳。由于产甲烷菌独特的厌氧代谢机制，使其在自然界碳素循环过程中起着重要作用，因此对于产甲烷菌的多样性以及代谢机制的研究越来越受到人们的关注。相对于传统的培养检测方法，分子生物学技术对于产甲烷菌的多样性及其群落结构的检测更为便捷、准确和科学。介绍了产甲烷古菌的系统分类学发展，系统地阐述了产甲烷菌定性和定量的分子生物学检测方法，总结了不同技术在产甲烷菌多样性研究中的最新成果，最后提出多种技术的复合应用将成为研究的热点。

关键词：产甲烷古菌；生物多样性；分子生物学技术；检测；复合应用

中图分类号： Q939.97文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0016-05

收稿日期：2014-03-07

基金项目：国家“973”计划（编号：2013CB733502）；国家自然科学基金（编号：21307058、21207065）；中国科学院环境与应用微生物重点实验室开放基金（编号：KLCAS-2013-05）；江苏省农业自主创新资金[编号：CX（13）3045]；江苏省高校自然科学研究面上项目（编号：13KJB610006）。

作者简介：张瑞（1990—），女，江苏连云港人，硕士，主要从事微生物和分子生物学的研究。E-mail：zhangrui1030@njtech.edu.cn。

通信作者：郑涛，男，教授，主要从事生物能源、生物材料方向的研究。Tel：（025）58139929；E-mail：zhengtao@njtech.edu.cn。能源和环境是制约当今世界经济可持续发展的两大关键问题，可再生生物质能源的研究显得尤为重要。沼气是最早被人们开发并获得广泛应用的一类可再生能源。沼气所产生的能量不仅能够减少化石能源的消耗，而且可以大大减少温室气体的排放，同时具有极大的经济效益，因此关于沼气的研究在世界范围内引起广泛的关注[1]。

微生物群落结构的组成决定其所具有的生态功能，对参与某一特定生物化学转化作用的微生物菌群的定性和定量研究对于探讨其参与反应的机理及关键步骤的解析具有重要的意义。沼气的产生是由多种微生物菌群协同参与的复杂转化过程，参与菌群可大致分为3类：水解和发酵细菌、专性产氢产乙酸菌和产甲烷古菌[2]。产甲烷菌作为厌氧发酵过程最后一步的关键菌群，其群落的组成和数量的变化将直接影响沼气发酵速率和最终的产气量。

产甲烷古菌大多以甲酸、甲基化合物、乙酸、H2/CO2为底物原料。近年来，随着Hungate厌氧操作技术的发展，人们对于产甲烷菌的研究越来越多。产甲烷菌存在于各种极端厌氧环境中，且在不同的生态环境下，产甲烷菌的群落组成也存在差异，其代谢过程也随着环境的不同而体现出多样性[3]。自然界中甲烷主要由3 种途径产生：乙酸发酵途径、氢营养型途径 （亦称CO2还原途径） 和甲基营养型途径。不同条件下，各个途径对甲烷生成的贡献率不同。近年来随着分子生物学技术的发展，如16S rRNA克隆文库技术、变性梯度凝胶电泳技术、限制性酶切片段长度多态性分析技术和稳定同位素核酸探针技术等多种分子生物学技术的应用，克服了传统培养方法所带来的的形态和生理的变化及不可培养微生物种群缺失的缺陷，使得人们对于产甲烷菌的群落组成及其代谢机制、动力学研究越来越深入。全面准确地了解参与沼气发酵的微生物种群结构，特别是产甲烷古菌的群落组成和结构变化规律，能够为沼气发酵过程的设计优化、微生物代谢调控等提供可靠的技术参数。

1产甲烷古菌的系统分类学发展

1974年，Bryant 首次提出了产甲烷菌（Methanogen）这一概念，将其与以甲烷为能量来源的嗜甲烷菌（Methanotrophs）区分开来[4]。2001年，《伯杰氏系统细菌学手册》将产甲烷菌放在宽广古生菌门（Euryarchaeota）中。他们广泛存在于各种厌氧环境中，如海水沉积物、湖泊沼泽及动物瘤胃、盲肠等自然生态系统环境中；也存在于废水、稻草秸秆、禽畜粪便等非自然生态环境中[5]。产甲烷菌分类形式多样，传统的分类是基于微生物的形态结构、生理生化特性等为依据进行的，鉴于产甲烷菌生长条件苛刻，生长速率一般较低，生物量也较少，培养方法特别，其所能利用的底物种类较少，且染色、形态特征也比真细菌易变和难确定，给传统分类法带来极大的挑战。迄今为止，仅有200多种产甲烷菌被分离鉴定出来，归属于3纲5目10科29个属[6]。其中5目分别为甲烷杆菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）、甲烷火菌目（Methanopyrales）[7]。随着分子生物学的发展，人们更多地利用系统发育学分类法，依据物种间小亚基核糖体核苷酸的差异性对产甲烷菌进行鉴定和分类[8]。

2分子生物学技术在产甲烷古菌多样性中的应用

产甲烷古菌群生活在极端厌氧环境中，对温度、pH值、底物浓度等因素非常敏感。Hungate厌氧操作技术的应用与发展使得产甲烷古菌的纯培养成为可能。然而传统的培养方法较为繁琐，且无法保持微生物生态环境的一致性，而分子生物技术因其在非培养条件下对微生物遗传信息进行研究，从而被认为是产甲烷菌研究的重要且有效的手段。1996年，伊利诺伊大学第一次完成了产甲烷菌Methanococcus jannaschii的基因组测序。近年来，人们越来越多地以基因组遗传信息为依据，并运用分子生物学技术来研究物种的种群多样性、群落结构组成、菌群功能及其代谢机理。这些分子生物学技术，例如变性梯度凝胶电泳 （denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、限制性片段长度多态性分析（restrictionfragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段长度多态性分析（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、荧光原位杂交技术（florescence in situ hybridization，FISH）等的引入，将产甲烷古菌这一重要环境微生物的研究带入了一个新时代。

2.116S rRNA/mcrA 基因克隆文库分析

16S rRNA基因克隆文库分析是在生物多样性研究中最常用的分子手段之一。1990年，Giocannoni等首次应用该方法分析马尾藻海海面的浮游微生物多样性[9]。该方法是基于对样品总DNA进行PCR克隆获得目的基因16S rRNA片段，将其连入载体导入宿主菌中，挑选阳性克隆进行测序，构建克隆文库，对所获得的克隆序列进行生物信息学分析，构建系统发育树，从而获得样品微生物系统多样性。这些种系或者分类操作单元（operational taxonomic units，OTU）的数目直接反映了某一种生物类的丰富度[10]。

甲基辅酶M还原酶 （methyl coenzyme-M reductase，MCR） 是甲烷生成过程中的关键酶，其α亚基 （McrA，由mcrA基因编码） 催化甲烷化反应中的最后一步，存在于所有产甲烷菌中[11]。基于其催化反应的独特性，可作为检测和区分产甲烷菌的分子标记[12]。1995年，Springer等成功验证了mcrA探针用于产甲烷古菌多样性分析的可行性[13]。Nolla-Ardèvol等利用mcrA基因序列分析中亚碱湖中产甲烷菌群，从而研究其作为高pH甲烷反应器接种物的适用性[14]。mcrA克隆文库技术已日趋完善，并且在产甲烷菌的研究中发挥着不可替代的作用。产甲烷古菌多样性分析中常用的引物序列可查阅文献获得（表1）。表1产甲烷古菌多样性分析中常用的引物序列

引物名称引物序列（5′→3′）PCR产物长度

（bp）参考文献16S rDNAArchaeal21Fa：TTCCGGTTGATCCYGCCGGA；Archaeal958Ra：YCCGGCGTTGAMTCCAATT900Delong[15]MEME1：GCMATGCARATHGGWATGTC；ME2：TCATKGCRTAGTTDGGRTAGT760Hales等[16]MCRMCRf：TAYGAYCARATHTGGYT；MCRr：ACRTTCATNGCRTARTT500Springer等[13]

近年来，16S rRNA/mcrA基因的克隆文库分析在沼气工程中的应用越来越广泛。2008年，Nettmann等首先将16S rRNA和mcrA分析应用于利用牲畜粪便以及玉米秸秆作为底物的中温商业沼气工程产甲烷古菌多样性的研究中[17]。研究中发现超过70%的古菌OTU都属于Methanomicrobiales，即耗氢型产甲烷菌，而乙酸型产甲烷菌占了很小的比重。从而推测CH4主要由H2和CO2途径产生。然而基于 16S rRNA/mcrA 基因克隆测序分析的方法仍然存在其固有缺点，为了更全面地分析样品的多样性，需要构建大量的克隆，耗时较长，且成本昂贵[18]。随着指纹识别技术的发展，通常将其二者结合使用来降低测序的费用[19]。

2.2变性梯度凝胶电泳

变性梯度凝胶电泳 （denatured gradient gel electrophoresis，DGGE） 最早由Fischer等提出，是用于检测DNA片段点突变的一种技术[20]。DGGE是根据长度相同但碱基序列不同的DNA片段在不同浓度梯度变性剂中解链行为不同而在电泳时迁移速率不同这一机理，从而将某一样品中不同种属菌株的DNA片段区分开。凝胶不同位置所形成的条带与样品中的优势菌群相关，再加以测序以及系统发育分析，进而可直接反映了样品的生物多样性。1993年，Muyzer等首次将其用于分析土壤环境中微生物群落结构研究中[21]。由于其可避免培养法所带来的偏向性，在不改变样品环境的情况下，对样品微生物群落组成及其多样性进行分析，因此又被广泛应用到海洋、高温、高盐、厌氧污泥、污水处理等环境微生物多样性的研究中。然而Hwang等利用DGGE对活性污泥厌氧反应器中的产甲烷菌群多样性进行研究时发现，基于古细菌的16S rRNA基因扩增的DGGE分析不能完全反映出样品中所存在的产甲烷菌分类[22]。这些差异性可能是由于PCR扩增、DNA提取或者是菌群本身的丰富度所造成的。因而DGGE一般并不单独作为分析技术应用，而是辅以其他的方法，例如与原位分子杂交技术复合使用，应用于硫酸盐还原菌的研究中[23]。Zakaria等利用FISH和DGGE发现Methanosaeta concilii是POME厌氧消化中的优势菌群，它是乙酸型产甲烷的重要菌群以及属于Methanosaeta潜在新菌的存在[24]。但当某种产甲烷菌含量较少，其DNA占总DNA量不足1%时，利用该技术很难检测出。

2.3荧光原位杂交技术

荧光原位杂交技术是用已知的被荧光标记的单链核苷酸片段作为探针，按照DNA碱基互补的原则，与待测样品基因组DNA 分子杂交，从而检测该特异微生物种群的存在与丰度的一种方法。探针的特异性适用于任一分类学水平的测定，甚至可以区分个体间的差异。16S rRNA基因的寡核苷酸探针是比较常用的一类探针，其使用对微生物生态学具有重大意义。1993年，Wagner等率先将此技术应用于活性污泥微生物群落检测中，之后此技术在应用中不断得到完善[25]。刘春等采用荧光原位杂交技术对阿维菌素废水工业化UASB反应器中颗粒污泥产甲烷菌群进行分析，发现产甲烷菌在不同粒径的颗粒污泥表面和内部剖面中分布形态相同但分布丰度存在差异。同时，该技术也在不断改进中，使其具有更大的适用性。Stoecker等用双标记的寡核苷酸探针来替代单标记探针，在一定程度上加强了待测微生物种群的信号强度，同时提高了探针的有效性[26]。

2.4限制性酶切片段长度多态性

限制性酶切片段长度多态性（RFLP）是根据DNA在限制性内切酶酶切后形成特定DNA片段的大小不同而发展起来的一种DNA标记技术。然而酶切位点变异经常会受到一些因素影响而突变，从而导致RFLP结果的准确度降低。末端限制性酶切片段长度多态性（T-RFLP）是基于RFLP发展起来的一种方法，由于其利用特定的标记引物对样品DNA进行特异扩增，之后进行限制性内切酶酶切，利用自动DNA测序仪对所获荧光标记T-RFS的大小以及相对丰度进行测定，大大避免了RFLP的不足。T-RFLP作为一种高通量指纹识别技术已经被应用于微生物群落结构以及组成的变化研究中[27]。1997年，Liu等利用此技术研究复杂环境微生物多样性，之后该技术被广泛应用于各种生态系统中[28]。Lueders等采用T-RFLP和富集培养的方法研究水稻土壤中产甲烷菌的多样性，发现大部分的产甲烷菌属于Methanosarcinaceae、Methanosaetaceae和Methanobacteriaceae，并且鉴定出未被辨别的mcrA序列属于RC-Ⅰ古菌成员[29]。Chin等利用 T-RFLP 技术和克隆文库结合的方法分析了温度对水稻土壤中产甲烷古菌结构和功能的影响，发现15 ℃和30 ℃时，种群结构发生明显变化，Methanosarcinacaeae由原来的7%上升到77%（30 ℃）和33%（15 ℃）[30]。基于网页的一些工具的开发，大大促进了T-RFLP引物以及限制性内切酶的选择[31]。如新工具restriction endonuclease picker （REPK） 可以根据研究者提供的不同样品序列来选择合适的限制性内切酶，使得基因的选择可以是多变的，而不是局限于16S rRNA。T-RFLP 应用也越来越广泛，包括真菌核糖体基因[32]，细菌16S rRNA基因[33]，古菌16S rRNA基因[34]及功能基因如固氮基因[35]、甲烷氧化基因[36]。

2.5实时定量PCR技术

实时定量PCR（real-time quantitative PCR）是基于PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时定量PCR是基于荧光共振能量转移的原理，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累对整个PCR进程进行实时监测，最后通过标准曲线对待测未知模板进行定量分析的方法。在实时定量PCR中，CT值是一个重要的参数。研究表明，每个模板的CT值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，从而只要获得未知样品的Ct值，就可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。该技术实现了DNA模板定量的同时，还具有灵敏度高、准确性强、能实现多重反应、无污染性和具实时性等优点。1992年，由Higuchi等首次提出实时定量PCR技术[37]，此后该技术在很多领域广泛应用。Sawayama等采用实时定量PCR技术对固定床厌氧反应器中固定化产甲烷菌系统发育进行分析，发现大部分固定化产甲烷菌属于甲烷八叠球菌属，自由存在的产甲烷菌大部分属于甲烷八叠球菌属和甲烷杆菌属，并成功实现了对固定化与自由存在产甲烷菌的定量分析[38]。Nettmann等利用实时定量PCR结合FISH技术分析了6个不同底物原料农业沼气罐中产甲烷古菌群落的多样性，大大丰富了对于大型沼气反应器中产甲烷古菌的研究[39]。王彦伟等利用实时定量PCR技术结合DGGE研究不同地区低温沼气池中前期、后期产甲烷古菌的群落变化情况，结果发现不同样品发酵前期、后期产甲烷古菌的优势群落及数量上都存在较明显的差异[40]。实时定量PCR更能反映出微生物菌群的真实情况并能对目的微生物进行准确定量。

2.6稳定同位素核酸探针技术

稳定同位素核酸探针技术（stable isotope probing，DNA/RNA-SIP）通过对微生物核酸进行同位素标记，从而在分子水平揭示特定元素在复杂环境中的微生物调控机制[41]。根据探测的核酸分子不同可以分为DNA-SIP和RNA-SIP[42]。2000年，Radajewski 等开发了DNA-SIP技术，并成功应用于森林土壤环境中[43]。2002年，Manefield 等利用RNA-SIP技术发现所研究的工业反应器中的苯酚降解菌主要是Thauera genus成员[44]。常用的稳定性同位素有13C 和 15N 等，标记原子增加了DNA的浮力密度，通过密度梯度离心，选择性回收13C 标记的DNA，可用于微生物的鉴定和代谢功能的分析。除了DNA 之外，RNA 和磷脂脂肪酸（PLFA）等也可被用作标记对象。由于RNA不依赖于细胞分裂，因此标记RNA相较于DNA更接近原位状况，灵敏度更高。目前稳定性同位素示踪技术在世界各国学者中掀起研究热潮。Nikolausz等利用稳定同位素示踪技术评价不同底物条件下厌氧反应器中主要产甲烷途径，发现以鸡粪为底物的反应器主要通过氢营养途径产甲烷，而在以玉米饲料和烘干谷物为底物的反应器中，2种产甲烷途径都存在，同时观察到在加入玉米饲料后，同位素数值发生了明显的改变，证实了将同位素示踪技术用作进程控制的工具是可行的[45]。Conrad等的研究结合了稳定同位素分馏效应和分子生物学技术，评价了不同产甲烷途径的贡献率。将稳定性同位素标记技术与分子生物学技术结合而成的稳定性同位素探测技术（SIP），为微生物群落结构、功能结构和代谢功能间关系的建立提供了新的解决方法。

Ginige等以13CH3OH标记的DNA作为模板进行16S rRNA基因序列扩增，发现与甲醇营养菌Methylophilales相关的16S rRNA基因在标记的DNA中具有较高的丰度；同时根据这些序列数据设计FISH探针进行原位杂交试验，结果表明活性污泥微生物群落的反硝化能力与SIP试验鉴定到的甲醇营养菌丰度相关；结合显微放射自显影技术，认定SIP试验中所鉴定的甲醇营养菌Methylophilales同时也是活性污泥中重要的反硝化菌[46]。Ginige等很好地证明了多种分子技术复合使用的巨大优势。然而在实际应用中，由于试验条件、技术水平等的限制，复合技术联合使用并未普及，在今后的研究中，复合技术的完善与推广将成为产甲烷菌多样性研究的热点。

3结论

传统的微生物研究方法是以纯培养为基础的，许多研究证实，通过传统方法鉴定出来的微生物不到环境微生物总数的10%。基于16S rRNA基因的现代分子生物学技术的出现，给环境微生物的研究提供了更加快速、准确的手段。除了上述列举的分子生物学技术，还有其他一些技术如单链构象多态性（single strain conformation polymorphism，SSCP）分析、实时逆转录PCR（real-time RT-PCR）技术等，这些技术各有优势。在对产甲烷菌多样性分析中，应注意技术本身的特殊性及存在的不足，采用多种分子技术复合使用，克服操作过程中存在的不确定因素，从而使对复杂系统中产甲烷菌群的结构及代谢途径的研究更加全面、准确，从而发挥产甲烷菌在环境和能源领域中的重要作用。

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