陈辉辉　金磊磊　喻镇东　等

摘要：对侵染中国江苏沿海滩涂盐碱地的互花米草茎和叶上真菌进行分离纯化，得到1株与侵染互花米草海洋真菌形态极其相似的菌株YDC07。对菌株YDC07进行培养性状观察和形态学鉴定，发现该菌与中国新记录菌属互花米草比尔格纳菌十分相似；通过rRNA基因ITS序列分子生物学鉴定，发现该菌与比尔格纳菌属中互花米草比尔格纳菌相似度为96%～99%，在进化树中显示亲缘关系最近；该真菌可以侵染互花米草秸秆，使其生物量逐渐减少。菌株YDC07 rRNA-ITS序列相关信息提交NCBI数据库，获得GenBank登录号为KJ459363。菌株YDC07是在江苏沿海滩涂盐碱地互花米草上新发现的一种比尔格纳菌属海洋真菌。

关键词：互花米草；海洋真菌；Buergenerula spartinae；rRNA-ITS；进化分析

中图分类号： Q949.32文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0342-05

收稿日期：2014-03-31

基金项目：国家自然科学基金（编号：30971898）。

作者简介：陈辉辉（1988—），男，江苏南京人，硕士，主要从事植物真菌及病毒研究。E-mail：huihui_chen2012@163.com。

通信作者：陈集双，博士，教授，主要从事植物真菌、病毒、植物反应器、秸秆资源化和产业化利用等研究。E-mail：biochenjs@njut.edu.cn。互花米草1979年引入我国，在减缓风暴潮压力、保护滩堤、促进围垦、消除近海污染等方面[1]发挥着积极作用，具有重要的生态价值，但因其耐受力和繁殖能力强等特性，导致其在与本土物种竞争、挤占贝类栖息地、改变滩涂景观、降低生物多样性等方面[2]产生消极作用，互花米草已成为我国沿海主要的入侵物种[3]。Kohlmeyer等研究资料显示，目前已经报道来自互花米草的专性和兼性海洋真菌有39种[4-5]，这些海洋真菌具有很强的分解木质纤维素和动植物尸体的能力[6-8]，具有潜在的应用价值。不过，对互花米草中海洋真菌的长期研究发现，仍然有很多未知海洋真菌没有被发现。研究表明，rRNA-ITS区在种内非常保守，种间却有较大变异。通常情况下，每种真菌的单倍体基因组rRNA拷贝数都会超过100个，可以很容易地从少量真菌组织中检测到rRNA；ITS区在真菌的种或变种之间虽然相似性很高，但仍有足够的种间序列差异，可以选择一些序列作为专化性引物[9]。目前，rRNA-ITS区分子检测是研究真菌菌种间同源性和遗传关系，进行菌种鉴定的一种有效方法[10-12]。

试验以江苏沿海滩涂盐碱地互花米草（Spartina alterniflora）植株的茎和叶为材料，对其进行海洋性真菌的分离纯化，并通过形态学观察及rRNA-ITS序列分析对菌株进行鉴定，为海洋性真菌的合理开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试样采集

互花米草茎和叶，于2012年10月9日采自江苏省大丰市大丰港沿海滩涂盐碱地。采集后的样品分成2份，1份直接用于真菌分离，另1份于4 ℃冰箱短期保存，备用。

1.2试剂与仪器

主要试剂有：异丙醇、甲醇、氯仿、无水乙醇，均为分析纯，市购；琼脂粉、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）等，市购；10 U/μL Taq DNA 聚合酶、脱氧核糖核苷酸（dNTPs），购自TaKaRa公司；DNA marker，Fermentas公司生产；DNA凝胶回收试剂盒，Axygen公司生产。主要仪器有：真空抽滤装置，光学显微镜。

1.3真菌的分离与纯化

真菌分离参照方中达的方法[13]进行，具体步骤为：把采集的互花米草叶和茎，浸泡在70%乙醇中10 s，无菌水反复漂洗3～5次；用有效氯含量34.0～46.0 g/L的NaClO溶液（巴氏消毒液），对互花米草叶和茎表面消毒3 min，用无菌水反复漂洗3～5次；将漂洗过的互花米草叶和茎用无菌滤纸吸去表面水分，移入PDA培养基平板中，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养；当菌丝体产生时，切去边缘菌丝接种到新的PDA培养基平板上纯化；反复纯化3代以上，得到纯种真菌菌丝。PDA培养基配方为去皮马铃薯200 g、葡萄糖或蔗糖18 g、琼脂18 g、蒸馏水1 000 mL；121 ℃灭菌20 min。

1.4形态学鉴定

1.4.1培养性状观察[14-17]将分离到的菌株YDC07接种于PDA平板中央，28 ℃静置培养；在培养1、3、5、7、15、30 d后观察、拍照、记录菌落形状、大小、色泽变化、表面菌丝和边缘特征、菌落质地及是否产生色素、是否产生孢子和产生孢子种类等。

1.4.2光学显微特征观察将载玻片洗净擦干，中间添加1滴灭菌水；用解剖针挑取少量菌丝体置于水滴中，让其充分散开；盖上干净的盖玻片，置于显微镜下镜检观察菌丝体粗细、分枝、是否有隔及是否产生分生孢子等特征。

1.5分子鉴定

1.5.1真菌基因组DNA提取将经分离纯化的真菌菌株YDC07的菌丝接种于PDA培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养3 d；通过真空抽滤装置过滤收集菌丝体，冷冻干燥；经液氮研磨，转移至1 mL EP管中，采用改良SDS-CTAB法[18]提取基因组DNA，溶解于加有适量10 μg/mL RNaseA的ddH2O中；用1%琼脂糖凝胶电泳检测。真菌基因组DNA提取液置于-20 ℃保存，备用。

1.5.2真菌ITS序列克隆以真菌菌株YDC07基因组DNA为模板，用White等设计的植物真菌通用引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′作为上下游引物[19]，进行ITS序列PCR扩增。扩增体系为50 μL：5 μL 10× PCR buffer，4 μL 25 mmol/L dNTP，1 μL 20 μmol/L ITS4，1 μL 20 μmol/L ITS5，1 μL模板DNA 50 ng，0.5 μL 10 U/L Taq聚合酶，37.5 μL ddH2O。扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，参照使用说明书，使用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒进行纯化回收；经纯化回收的产物与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞DH5α；在含Amp/IPTG/X-gal的LB 平板上，经蓝白斑筛选得到阳性白斑；通过碱法提取重组质粒DNA，经EcoRⅠ和Hind Ⅲ单双酶切鉴定及PCR扩增检验阳性克隆产物，经鉴定为阳性的质粒送到南京金斯瑞公司进行DNA测序（ABI 3730xl DNA analyzer，Perkin-Elmer，USA）。endprint

1.5.3真菌rRNA-ITS序列系统进化分析测得的序列在GenBank数据库中进行Blastn相似性比对，下载同源性较高的序列，用ClustalX 1.83[20]软件进行多级比对；利用Bioedit软件手工将比对结果进行加工，去掉长序列的多余部分；用MEGA 4.0软件构建系统进化树[21]，进化树由Bootstrap Test of Phylogeny中Neighbor-Joining（NJ）法制作完成。

1.6互花米草秸秆被真菌YDC07侵染后症状及其生物量变化

把晒干的互花米草秸秆高温灭菌，称量记录秸秆的干质量；接种针挑取一块真菌菌丝放到PDA平板中央，没有接种菌丝的PDA平板做为对照；将灭菌的互花米草秸秆在无菌条件下分别接种到有菌丝和没有菌丝的PDA培养基四周，每天观察记录真菌对互花米草秸秆的侵染情况；接种7、14、30 d后取出平行的3组互花米草秸秆，去除菌丝并晒干，称量记录秸秆的干质量。

2结果与分析

2.1培养性状

由图1可见，菌株YDC07菌丝在PDA培养基上前期生长速度较慢，后期较快，且为等径生长，7～8 d即把直径为 9 cm 的平板铺满；菌丝前期为白色透明状，后逐渐转变为浅褐色，最后转变为黑褐色，生长到后期，菌丝开始老化变成深黑褐色；菌落形态为转轮状，中长细杆绒丝状，层状排列，大量时呈发丝状堆积，边缘整齐，边缘一圆环状菌丝与内部圆形菌丝颜色稍有差别；培养3 d的气生菌丝为白色，呈绒状，基内菌丝产少量灰褐色脂溶性色素，5 d左右气生菌丝表面逐渐呈灰褐色，脂溶性色素颜色加深，7 d后培养基色素呈黑褐色，表面灰褐色菌丝逐渐转变为黑褐色，15 d时气生菌丝全部变为黑褐色，脂溶性色素彻底转变为深黑褐色，30 d左右菌丝开始成块老化脱落。菌株YDC07菌落的生长特征与互花米草比尔格纳菌（B. spartinae）及小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis）特征[22]相吻合。

2.2光学显微特征

由图2可见，菌株YDC07菌丝体细长，交织成网状，部分分枝与主枝成直角或锐角，菌丝有隔；随着菌丝生长，菌丝逐渐变粗、变成熟，菌丝顶端会逐渐出现螺旋成团状分布的分生孢子，孢子不断变多、变大、成熟。菌株YDC07的菌丝特征与互花米草比尔格纳菌及小麦全蚀病菌基本一致[22]。

2.3真菌rRNA-ITS序列进化分析

菌株YDC07基因组DNA的提取结果如图3-A所示。rRNA基因ITS序列扩增引物ITS4和ITS5的扩增区段包括18 S和28 S的部分序列及ITS1、ITS2和5.8S的全部序列[23]，菌株YDC07基因组的扩增结果为598 bp（图3-B）。

菌株YDC07基因序列在GenBank数据库中Blast检索，经初步比对，提交序列与100条序列相似性很高，比对e值都为0。表1为列出的部分比对结果，由此可见，提交序列与来自于互花米草比尔格纳菌种的ITS1-5.8S-ITS2区段相似度为96%～99%、覆盖率为89%～94%，其中，与Buergenerula spartinae strain SAP12、Buergenerula spartinae strain SAP124和Buergenerula spartinae strain SAP126的同源性最高，相似性为99%，其次是Buergenerula spartinae strain ATCC 22848，相似性为96%；提交序列与很多小麦全蚀病菌属品种和几株Magnaporthe salvinii品种、柱孢属品种（Cylindrocarpon）的ITS1-5.8 S-ITS2区段序列相似度较高，同源性在89%～95%、覆盖率在73%～97%。

由图4可见，菌株YDC07与B.spartinae归为1族。根据rRNA-ITS区序列同源性分析，菌株YDC07 rRNA-ITS序列与互花米草比尔格纳菌品种同源性最高，结合该菌的培养性状、光学显微观察结果，确定菌株YDC07为比尔格纳属真菌，是与该属中互花米草比尔格纳菌种极其相似的一种新记录海洋真菌。

2.4互花米草秸秆被真菌YDC07侵染后症状及其生物量变化

由图5可见，接种真菌YDC07的互花米草秸秆上有菌丝长出，而没有接种真菌YDC07的互花米草秸秆则没有。对接种前后互花米草生物量统计发现，侵染真菌YDC07的互花米草秸秆干质量，7、14、28 d后分别减少0.013 3、0.070 6、0.166 0 g，互花米草生物量逐渐减少。

3结论与讨论

互花米草比尔格纳菌是丝状子囊菌中唯一一个可以直接通过显微观察确定菌株的归属，而不需要进一步通过对真菌rRNA-ITS区扩增进行ITS序列进化分析的菌株[5，24]。随着分子鉴定方法的发展，先前许多根据传统形态学特征进行物种分类的方法受到质疑，结合分子遗传进化特征及形态学鉴定进行物种分类，是更科学、更准确的分类方法[25]。Schroeder等研究表明，真菌rRNA-ITS序列分析对解开绝大多数盐沼地海洋真菌分类和进化关系之谜有着极其重要的作用[26-29]。Gessner等研究认为，互花米草比尔格纳菌主要入侵互花米草的茎和叶[5]，这个入侵部位与本试验结论较为一致。

通过对分离自江苏沿海滩涂盐碱地互花米草海洋真菌菌落的培养性状观察、菌丝光学显微特征观察及rRNA基因组ITS序列系统进化分析，确定分离得到的菌株YDC07和中国新记录属中比尔格纳属互花米草比尔格纳菌（B. spartinae）成员特征相吻合， 因此，将其命名为B. spartinae YDC07。菌表1菌株YDC07基因序列与GenBank数据库比对相似率较高的菌株

序列登录号菌株名称相似性endprint

（%）覆盖率

（%）AF422960.1Buergenerula spartinae strain SAP129994AF422961.1Buergenerula spartinae

株YDC07是在江苏省大丰市大丰港沿海滩涂盐碱地的互花米草中分离得到的，与已报道的互花米草海洋真菌互花米草比尔格纳菌生存环境一致，这也进一步证实YDC07真菌的分类归属是正确的。目前，菌株B. spartinae YDC07的菌丝中存在线粒体病毒，这是首次在江苏大丰港沿海滩涂盐碱地的入侵植物互花米草中发现携带线粒体病毒的海洋真菌，向NCBI提交真菌B. spartinae YDC07的rRNA-ITS序列及该真菌携带线粒体病毒的序列，获得菌株B. spartinae YDC07的GenBank登录号为KJ485703。另外，试验表明，如B. spartinae YDC07侵染互花米草秸秆，则互花米草秸秆的生物量会逐渐减少。

本试验研究一方面丰富了入侵江苏沿海滩涂盐碱地互花米草的海洋真菌种类，另一方面对NCBI数据库中关于沿海滩涂互花米草的入侵海洋真菌及其携带病毒数据进行了补充。

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