田 飞，李翠新，何 德

（西南林业大学，云南 昆明650224）

1 引言

在构建全长cDNA文库时，连接和转化是关键步骤。在做样品与载体连接之前，去除由PCR扩增不完全和限制性内切酶酶切产生的非全长cDNA片段是必不可少的工作，残留的非全长cDNA片段会直接影响连接效果，影响建成文库的代表性、冗余度和挑取单克隆测序的工作量[1～3]。而SMART技术中去除非全长cDNA片段的方法也由其创立的CLONTECH公司从2001年的胶回收法[4]，改为 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法，而在近几年又改为CHROMA－SPIN 400柱离心法。然而多年来广大的科研工作者大多数只是对其提供的去除方法进行延用，却没有见到对这3种方法进行平行比较和取舍的研究报道[5，6]。本文作者通过实验发现最新的CHROMA－SPIN 400柱离心法的纯化效果并不理想，所以对这3种方法做了一个综合比较，以期得到最经济有效的纯化方法，为后继实验者提供指导和参考。

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

小桐子花采自云南省昭通市巧家县。琼脂糖购自BIOWEST公司，胶回收试剂盒购自OMEGA公司，CHROMA－SPIN 400柱购自CLONTECH公司，PCR仪购自 BIORAD公司，型号为 C1000TM Thermal cycler，枪头和离心管购自美国Labnet公司，其他试剂均为国产分析纯。

2.2 扩增并酶切cDNA

将反转录得到的cDNA用PCR仪扩增后，取160μL扩增液，用SfiⅠ限制性内切酶酶切处理，备用。具体操作参照 CLONTECH 公司的 CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit说明书。

2.3 胶回收法纯化

取50μL酶切过的PCR扩增液跑琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒做胶回收，胶回收液标记为1号处理液，－20℃冰箱中保存备用。

2.4 CHROMA－SPIN 400柱重力自流法纯化

取20个灭菌处理过的2mL离心管，编号1到20。从冰箱中取出一支CHROMA－SPIN 400柱，室温放置1h活化，颠倒数次后垂直放置于一支架上，让管中的树脂重新沉降成柱。……