董贺 孙青

·述评·

分子病理学技术在肿瘤诊治中的应用

董贺 孙青★

近几十年来，新兴学科——分子病理学的出现，使得人类对疾病特别是肿瘤的研究从器官、组织、细胞水平深入到蛋白、染色体和DNA水平。这不仅能为病理诊断提供更准确、更客观的依据，且可更好地指导肿瘤的靶向治疗和预后判断等，极大地推动了病理学的发展。分子病理学的技术如免疫组化、原位杂交、基因突变检测、生物芯片、流式细胞术等，已经得到了广泛应用，并将在未来的医疗领域里扮演越来越重要的角色。本文就近年来分子病理学技术在肿瘤诊治中的应用进行综述。

分子病理学技术；肿瘤诊治

传统病理学通常分为诊断病理学和实验病理学。前者通过尸体解剖（autopsy）、活体组织检查（biopsy）和细胞学（cytology）检查对疾病做出最终诊断；后者则以动物实验或在体外培养的细胞为材料进行研究。近几十年来，随着分子生物学、免疫学、遗传学等学科的发展和免疫组化、原位杂交、流式细胞术等技术的应用，极大地推动了病理学的发展，逐渐形成了一门新的分支学科——分子病理学，使得对疾病特别是肿瘤的研究从器官、组织、细胞水平深入到蛋白、染色体和DNA水平；并使形态学观察从定性走向定位、定量，更具客观性和可重复性。而分子病理学技术能为病理诊断提供更准确、更客观的依据，从而更好地指导肿瘤的靶向治疗和预后判断等，是现代病理学发展的方向和必不可少的手段。下面就相关分子病理学技术在肿瘤诊治中的应用作简要介绍。

1 免疫组织化学（immunohistochem istry，IHC）

免疫组织化学是在蛋白水平上，利用抗原抗体的特异性结合反应检测和定位组织和细胞中某种蛋白成分的技术。免疫组化技术有较高的特异性和敏感性，能同时将细胞成分定位与形态学改变结合起来，且直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测，结合计算机图像分析等技术，可对被检测物质进行定量分析。现在已经广泛应用于各种蛋白表达水平的检测、细胞属性和来源的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究、激素受体和耐药基因蛋白表达的检测等。如对乳腺癌患者进行ER、PR、HER2的检测可以判断患者的预后和对靶向治疗药物（赫赛汀等）的敏感性及指导内分泌治疗［1］；进行ERCC、RRM 1、TS、TOPOIIA、β-tubulin-Ⅲ等耐药基因蛋白表达的检测，以预测其对抗肿瘤化疗药物如铂类、吉西他滨、培美曲赛和紫杉醇类的疗效等［2－3］。

2 原位杂交（in situ hybridization，ISH）

原位杂交是用经标记的核苷酸片段作为探针，通过杂交直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位某一特定靶基因存在与否的技术。ISH的原理是DNA变性、复性和碱基互补配对结合。根据探针标记物的不同，如荧光素、地高辛、生物素、放射性物质等，又分为荧光原位杂交，显色原位杂交，银染原位杂交等。

2.1 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）

FISH可以检测基因（染色体）在较大的范围内发生的异常改变，如基因扩增、基因缺失、染色体转位或染色体数目变化等，因其性能稳定和结果直观等优点，已有很多商品化的试剂盒，如美国Vysis、北京金菩嘉、广州安必平等。目前主要被用于乳腺癌和胃癌HER2基因扩增，尿路上皮癌、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、性染色体的检测和产前诊断。在免疫组化检测乳腺癌和胃癌HER2蛋白表达意义不明确时，需做FISH检测进一步验证其有无HER2基因的扩增，以正确指导赫赛汀的应用；此外还对化疗以及疾病的预后预测有重要的指导意义［4］，是判断HER2基因扩增的金标准。FISH一般采用双色探针标记，其优点是对比鲜明，红色信号和绿色信号融合时可产生黄色信号，可用于一些融合或转位基因的判断。缺点是需配备荧光显微镜及采图软件（FISH工作站），且玻片不能长期保存。

2.2 显色原位杂交（chromogenic in situ hybridization，CISH）

CISH的应用也很广泛，即一般意义的原位杂交。利用生物素和亲合素系统标记探针和第一抗体，用辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）标记第二抗体，以DAB系统显色后，就可在组织切片上把目的DNA标记出来。如应用原位杂交法检测人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）、EB病毒（epstein-barr virus，EBV）等。原位杂交与免疫组化相比，具有高度特异性，尤其在无法得到可靠抗体时，不失为一种较好的检测方法。在普通光学显微镜下即可观察且能长期保存是其独特的优势。缺点是操作步骤多，易出现不稳定因素和人为差异［5］。

2.3 银染原位杂交（silver in situ hybridization，SISH）

近年来发展起来的SISH技术，将银沉淀和酶标记显色方法相结合，把HER2基因标记为黑色信号，染色体着丝粒标记为红色信号，标记过程在全自动免疫组化机上进行，并能在普通光学显微镜下观察并判读，且能永久保存，结果与FISH符合率高，可达94～99％［6－7］。随着探针成本的降低其将具有更广阔的应用前景。

3 基因突变检测

近年来兴起的针对肿瘤的靶向治疗，与传统的化学疗法相比，其特点在于能选择性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞低损伤或无损伤，具有高选择性和不良反应少的优点。而实现有效靶向治疗建立在检测靶基因是否发生突变的基础上。因此，基因突变检测对指导肿瘤的靶向治疗非常关键。其中有些已经得到广泛应用，如EGFR基因突变检测易瑞沙和特罗凯等靶向药物是否适用于非小细胞肺癌患者［8］，KRAS基因突变检测西妥昔和帕尼等是否适用于结直肠癌患者［9］，KIT和PDGFRA基因突变检测胃肠道间质瘤患者是否会对靶向治疗药物伊马替尼产生耐药性［10］等。

基因突变是指染色体上一个位点内遗传物质的变化，主要形式有点突变、缺失突变、插入突变、基因易位或重排、甲基化及其他方式导致的基因结构异常。基因突变导致的癌基因突变、抑癌基因失活、基因表达失调等是肿瘤发生的重要因素。目前检测基因突变的方法有测序法、实时定量荧光PCR法、高分辨率熔解曲线法、扩增阻滞突变系统法等。

3.1 基因测序（gene sequencing，GS）

此技术能够最真实地反映基因上的信息，被普遍认为是分子诊断的金标准。目前已由经典的Sanger测序发展到二代测序技术，如Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术以及ABI公司的SOLiD技术等；测序通量也急速提高，费用则大大降低［11－12］。相对于Sanger测序，其它方法尽管灵敏度或特异度有所提高，但只能针对一些已知的常见突变进行，不能用于检测罕见或未知突变。而Sanger测序的缺点则是检测过程比较繁琐，耗时长；对标本中所含肿瘤组织的量要求比较高，且敏感性低，一般不能检出低于20％的突变［13］。

3.2 高分辨率熔解曲线（high resolutionmelting，HRM）

HRM是一种在实时定量荧光PCR的基础上，通过饱和染料监测核酸的熔解曲线变化并进行分析的方法。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）位点不匹配会使双链DNA在升温过程中先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP位点与不同基因型。HRM检测无需使用序列特异性探针，不受突变碱基位点和种类的局限，具有高灵敏度、成本低、高通量等优点，可应用于突变筛选、基因分型等多方面［14－15］。由于HRM能够对单碱基差异进行区分，所以对温度分辨率的要求相当高，需要特定的仪器或配件。Ma等［16］分别用直接测序法和HRM方法检测了100例结直肠癌患者的KRAS基因突变，HRM方法可检出11种突变类型，较测序法更为敏感，两种方法的一致性达95％。

3.3 扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）

ARMS法利用扩增阻滞突变的原理设计探针，如其中EGFR 29型的试剂盒涵盖了EGFR基因的29个突变点，包括3种18外显子突变、19种19外显子突变、5种20外显子突变和2种21外显子突变等，能检测绝大多数已知的EGFR基因突变类型。此法灵敏度高，能检出1％的常见突变，尤其是对于肿瘤细胞含量较少的样本，如穿刺、体液样本等具有很大的优势［17］；且其操作简便，耗时短，若与Sanger测序联合应用将使诊断更全面可靠。

4 生物芯片

生物芯片技术是近来影响深远的重大科技进展之一，是融生物学、微电子学和计算机科学等为一体的前沿技术。该技术将高密度的核酸、蛋白质、组织等包被在硅片、玻片等固相支持物上，通过设计不同的阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的用途，如基因表达谱研究、基因突变检测、多态性分析、产前诊断、分子标志物筛选等，为功能基因组的研究及医学诊断的发展提供了有力的工具。

4.1 基因芯片

采用基因芯片可分析患者和肿瘤高发人群的基因表达谱，并与正常对照组进行比对，为发现肿瘤致病基因提供线索；同时通过检测突变基因，还对具有发生肿瘤风险的个体提前预警；并使基于广泛基因表达分析的肿瘤分类方法成为可能，以区分利用常规手段难以辨明的肿瘤，提高了诊断的准确率［18］。在产前诊断方面，基因芯片由于成本限制，尚未成为主流手段，但其相对于传统产前检测技术，仍具有高分辨率的优势和广阔的前景［19］。

4.2 蛋白质芯片

蛋白质芯片技术为肿瘤标志物的联合检测提供了理想工具。现已有多篇文献报道，利用蛋白质芯片来检测肿瘤相关的血清蛋白，并利用联合诊断的方法对样品进行分级［20－21］。如卵巢癌单个肿瘤标志物CA125已经被IL-18、FGF-2和CA125联合诊断所取代［22］。由于血清蛋白的变化受性别、激素水平及营养状况等影响，而对肿瘤组织进行原位研究可以避免这些影响。Melle等［23］利用蛋白质芯片系统和显微切割技术分析头颈部肿瘤组织及其邻近淋巴结，找出了2个有显著差异表达的蛋白，未来可以作为肿瘤诊断和预后判断的新指标。

4.3 组织芯片

组织芯片将很多微小组织整齐地排列在一起，从而提供了一种高通量、大样本以及快速的疾病形态学分析工具。组织芯片技术与传统的病理学相结合，可做HE染色、特殊染色、免疫组化、原位杂交等。它的优点是具有良好的内对照和实验条件的一致性。林茂松等［24］采集了54例直肠癌组织和40例癌旁直肠粘膜组织制成组织芯片，采用免疫组织化学染色方法检测了多种蛋白因子的表达，结果发现p53、CyclinD1、Bcl-2的异常表达与直肠癌的发生有关。

5 其他方法

5.1 流式细胞术（flow cytometry，FCM）

流式细胞术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选的技术，适用于单细胞悬液的样本（可以是血液、体液和细胞培养悬液），它是免疫细胞化学、激光和计算机科学综合的产物。流式细胞术在肿瘤诊治领域现也得到了广泛的应用。DNA非整倍体的出现是癌前病变向早期癌变发展的一个重要指标。流式细胞术可测定DNA含量的变化，即DNA非整倍体的出现，对癌前病变的性质及发展趋势做出评估，有助于癌变的早期诊断。流式细胞术还可以应用在白血病和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma，NH）的分型方面。传统形态学检查是诊断白血病的基础，但有局限性。当遇到形态学难以诊断的白血病，只有靠免疫分型来辅助诊断。目前白血病免疫分型主要用流式细胞术进行以下检测：（1）急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukem ia，ALL）的类型及分化阶段；（2）急性髓细胞性白血病（acutemyelocytic leukem ia，AML）的亚型；（3）诊断急性未分化白血病、一些少见类型白血病和混合型白血病；（4）指导治疗和判断预后等［25－26］。在临床上，T淋巴细胞亚群分析对于肿瘤患者免疫功能的监测具有重要的意义［27］。流式细胞术可以通过对肿瘤细胞和免疫细胞状态的监测来评估疗效，从而调整治疗方案［28］。研究发现，肿瘤干细胞是肿瘤耐药性和复发的根源［29］。流式细胞术还可以通过针对肿瘤干细胞的特殊标记，将肿瘤干细胞分选出来，对其进行研究，以达到彻底治愈肿瘤的目的［30］。

5.2 PCR-反向点杂交法（PCR-reverse dot hybridization，PCR-RDH）

将PCR反应产物与载有特定序列探针的膜条进行杂交以显示出结果。可用于检测HPV，对宫颈样本、阴道分泌物、其他新鲜或石蜡活检样本，通过简单的DNA提取、PCR、杂交几个步骤，就能在膜条上对HPV分型。目前市场上有HPV 28型检测试剂盒，能检出15种高危型、3种疑似高危型和10种低危型。

5.3 实时荧光定量PCR（real time PCR，RT-PCR）

此方法利用荧光共振能量转移的原理，用荧光信号的强度定量检测PCR产物，即模板DNA的拷贝数，在分子病理学中得到了广泛应用。如检测结核杆菌等病原菌，能检出最低103个拷贝数／m L，比传统的特殊染色的检出率提高很多。还有对非小细胞肺癌（non-small cell long cancer，NSCLC）的间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因［31－32］用RT-PCR方法检测，相对于FISH法来说，灵敏度更高，结果判断更为客观；缺点是样本中RNA易降解，且易污染，对实验室环境要求高［33］。RT-PCR也常用于对其他病原菌如肝炎病毒等的检测［34－35］。

6 小结与展望

[1]Caldarella A,Crocetti E,Bianchi S,et al.Female breast cancer status according to ER,PR and HER2 expression:a population based analysis[J].Pathol Oncol Res,2011,17(3):753－758.

[2]M ilovic-Kovacevic M,Srdic-Rajic T,Radulovic S,et al.Expression of ERCC1、RRM 1、TS protein in biopsy specimen predicts survival in advanced ovarian cancer patients treated with platinum-based chemotherapy[J]. Buon,2011,16(4):708－714.

个体化治疗和靶向用药是未来医疗的必然趋势，而这均建立在对患者进行全面检测的基础上，如用免疫组化检测细胞中蛋白的表达水平，用原位杂交和基因突变检测分析细胞中核酸的含量及改变，用生物芯片来进行规模化的分析和比对等等。随着医疗水平的提高和各种新技术的应用，分子病理学必将在未来的医疗领域里扮演越来越重要的角色。

[3]Ranganathan S,Benetatos CA,Colarusso PJ,et al. A ltered-tubulin isotype expression in paclitaxel resistant human prostate carcinoma cells[J].Br JCancer,2008, 77(4):562－566.

[4]Fornier M,Risio M,van Poznak C,et al.HER2 testing and correlation w ith efficacy of Herceptin therapy[J]. Oncology,2002,16(10):1340-1352.

[5]林蓁.原位杂交检测HPV和EBER中常见问题和对策[J].临床与实验病理学杂志,2014,30(8):928-930.

[6]Shousha S,Peston D,Amo-Takyi B,et al.Evaluation of automated silver-enhanced in situ hybridization (SISH)for detection of HER2 gene amplification in breast carcinoma excision and core biopsy specimens [J].Histopathology,2009,54(2):248-253.

[7]Papouchado BG,Myles J,Lloyd RV,et a1.Silver in situ hybridization(SISH)for determ ination of HER2 gene status in breast carcinoma:comparison with FISH and assessment of interobserver reproducibility[J].Am JSurg Pathol,2010,34(6):767-776.

[8]Byers LA,Heymach JV.Dual targeting of the vascular endothelial grow th factor and epidermal grow th factor receptor pathways:rationale and clinical applications for non-small cell lung cancer[J].Clin Lung Cancer, 2007,8(Suppl2):79-85.

[9]Andre T,Boni C,Mounedji-Boudiaf L,et al.Fluorouracil and leucovorin as adjuvant treatment for colon cancer[J].N Engl JMed,2004,350(23):2343-2351.

[10]Blanke CD.Long-term results from a random ized phaseⅡtrial of standard-versus higher-dose imatinib mesylate for patients w ith unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT[J].JClin Oncol,2008,26(4):620-625.

[11]Schuster SC.Next-generation sequencing transforms today's biology[J].Nat Methods,2008,5(1):16-18.

[12]Sultan M,Schulz MH,Richard H,et al.A global view of gene activity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome[J].Science, 2008,321(5891):956-960.

[13]Wang XY,Liu YR,Niu YJ,et al.Advanced detecting techniques of EGFR mutation for non-small cell lung cancer[J].International Journal of Respiration,2012,32 (10):797.

[14]Vossen RH,Aten E,Roos A,et al.High-resolution melting analysis(HRMA):more than just sequence variant screening[J].Hum Mutat,2009,30(6):860-866.

[15]Garritano S,Gemignani F,Voegele C,et al.Determing the effectiveness of high resolution melting analysis for SNP genotyping and mutation scanning at the TP53 Locus[J].BMC Genet,2009,10:5.

[16]Ma ES,Wong CL,Law FB,et al.Detection of KRAS mutations in colorectal cancer by high-resolutionmelting analysis[J].JClin Pathol,2009,62(10):886-891.

[17]Brevet M,Johnson ML,Azzoli CG,et al.Detection of EGFR mutations in plasma DNA from lung cancer patients by mass spectrometry genotyping is predictive of tumor EGFR status and response to EGFR inhibitors [J].Lung Cancer,2011,73(1):96-102.

[18]Pal NR,Aguan K,Sharma A,et al.Discovering biomarkers from gene expression data for predicting cancer subgroups using neural networks and relational fuzzy clustering[J].BMC Bioinformatics,2007,8:5.

[19]de Jong A,Dondorp WJ,Macville MV,et al. Microarrays as a diagnostic tool in prenatal screening strategies:ethical reflection[J].Hum Genet,2014,133 (2):163-172.

[20]Darcy KM,Schilder RJ.Relevantmolecular markers and targets[J].Gynecol Oncol,2006,103(Suppl 1):S6-S13.

[21]Orchekowski R,Hamelinck D,Li L,et al.Antibody Mcroarray Profiling Reveals Individual and Combined Serum Proteins Associated w ith Pancreatic Cancer[J]. Cancer Res,2005,65(23):11193-11202.

[22]Page C,Ouellet V,Madore J,et al.From gene profiling to diagnostic markers:IL-18 and FGF-2 complement CA125 as serum-based markers in epithelial ovarian cancer[J].Int JCancer,2006,118(7):1750-1758.

[23]Melle C,Ernst G,Schimmel B,et al.A technical triade for proteomic identification and characterization of cancer biomarkers[J].Cancer Res,2004,64(12):4099-4104.

[24]林茂松,陈卫昌,黄俊星,等.组织芯片研究直肠癌中肿瘤相关基因的表达[J].肿瘤防治研究,2010,37(2): 141-145.

[25]Hassan KA,Wang L,Korkaya H,et al.Notch pathway activity identifies cells w ith cancer stem cell-like properties and correlates w ith worse survival in lung adenocarcinoma[J].Clinical cancer research,2013,19 (8):1972-1980.

[26]Yang ZF,Ngai P,Ho DW,et al.Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer [J].Hepatology,2008,47(3):919-928

[27]Shikawa T,Saito H,Osaki T,et al.Elevated fas expression is related to increased apoptosis of circulating CD8+T cell in patientsw ith gastric cancer[J].JSurg Res,2008,148(2):143-151.

[28]Wee JG,Guat BT,Ponudurm K,et al.Establishment of adult peripheral blood lymphocyte subset reference range for an Asian population by single-platform flow cytometry:influence of age,sex,and race and comparison w ith other published studies[J].Clin Diagn Lab Immunol,2004,11(2):168-173.

[29]Madka V,Rao CV.Cancer stem cell markers as potential targets for epithelial cancer[J].Indian JExp Biol,2011,49(11):826-835.

[30]Chen T,Yang K,Yu J,et al.Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients[J].Cell Res,2012,22(1):248-258.

[31]Kim DW,Ahn MJ,Shi Y,et al.Results of a global phase IIstudy w ith crizotinib in advanced ALK-positive non-small cell lung cancer[J].JClin Oncol,2012,30 (supple):488s.

[32]Zhang X,Zhang S,Yang X,et al.Fusion of EML4 and ALK is associated w ith development of lung adenocarcinomas lacking EGFR and KRAS mutations and is correlated w ith ALK expression[J].Mol Cancer, 2010,9:188.

[33]刘标,周晓军.非小细胞肺癌个体化治疗的靶向分子检测[J].临床与实验病理学杂志,2012,28(8):831-837.

[34]Park Y,Lee JH,Kim BS,et al.New automated hepatitis C virus(HCV)core antigen assay as an alternative to real-time PCR for HCV RNA quantificatin [J].JClin M icrobiol,2010,48(6):2253-2256.

[35]Hao Y,Zhang XY,Hu Y,et al.Comparison of a novel real-time PCR assay w ith sequence analysis,reverse hybridization,and multiplex PCR for hepatitis B virus type B and C genotyping[J].JClin M icrobiol,2011,49 (9):3392-3394.

The application ofmolecular pathological technology in the diagnosis and treatment of tumors

DONG He,SUN Qing★
(Department of Pathology,Qianfoshɑn Hospitɑl A ffiliɑted to Shɑndong University,Jinan,Shandong,China, 250014)

In recent decades,the development of molecular pathology has deepen people’s know ledge of disease and tumor from the level of organ,tissue,cell to the level of protein,chromosome and DNA.Themolecular pathological technology has greatly promoted the development ofmodern pathology by providing more precisive and objective evidence to guide the target therapy and prognosis of tumors.Molecular pathological technology has been w idely applied,such as immunohistochemistry,in situ hybridization,gene mutation detection,biochips,flow cytometry and so on.The molecular pathology w ill play amore and more important role in the futuremedical treatment.Here we summarize the application of molecular pathology technology in recent years in the diagnosis and treatment of tumors.

Molecular pathological technology；Diagnosis and treatment of tumors

国家自然科学基金（81272420）；山东省科技发展计划（2011GSF11838）；山东自然科学基金（2R2012HM 085）；济南市科技发展计划项目（201202039）

山东大学附属千佛山医院病理科，山东，济南250014

★通讯作者：孙青，E-mail：qingsw99＠163.com