冯宪敏，王月华

(吉林医药学院病原教研室，吉林 吉林　132013)

·综述·

棘阿米巴角膜炎模型和实验室诊断研究进展Research Progress on animal model and laboratory diagnosis of Acanthamoeba keratitis

冯宪敏，王月华

(吉林医药学院病原教研室，吉林 吉林132013)

摘要：棘阿米巴原虫是一种机会致病自由生原生生物，主要引起人类两种疾病，即棘阿米巴脑炎和棘阿米巴角膜炎。本文综述了阿米巴角膜炎实验室诊断的研究进展。

关键词：棘阿米巴原虫；棘阿米巴角膜炎；动物模型；实验室诊断

文章编号：1673-2995(2015)02-0119-03

中图分类号：R772.2

文献标识码：识码： A

基金项目：国家自然科学基金项目(81301450)；吉林省教育厅项目(2014367,2014373).

作者简介：冯宪敏(1976-)，女(汉族)，副教授，博士.

收稿日期：( 2014-11-06)

致病性棘阿米巴(Acanthamoeba)是一种自由生活的机会致病性原虫，其生活史包括包囊和滋养体两个发育阶段。广泛分布在土壤、淡水、灰尘甚至沙漠中，其入侵途径尚不完全清楚，已知可从皮肤伤口、穿透性角膜外伤、损伤的眼结膜或经呼吸道、生殖道等进入人体。多数寄生于脑、眼、皮肤等部位。棘阿米巴可引起人类两种疾病，一种是棘阿米巴脑炎,另一种是致盲性角膜炎。棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba Keratitis,AK)是一种严重威胁视力的感染性眼病,其发生与一定的危险因素有关[1],如佩戴角膜接触镜、接触污染的水源、角膜轻度擦伤以及机体抵抗力降低等是其主要诱因。1973年英国Nagington等报道首例AK患者，近年来随着角膜接触镜的广泛使用和AIDS患者的急速增加，AK越来越受到有关研究者的广泛重视。

1AK模型

AK动物模型的建立对于AK分子生物学、病原学和免疫学机制的研究以及抗棘阿米巴药物筛选具有重要意义。常用于AK模型的动物包括大鼠、小鼠、猪、兔和中国沙鼠等[2-5]。Ren等[6]分别以大鼠、小鼠和新西兰白兔作为模型动物，采用角膜接触镜、角膜刮伤和角膜基质内注射的方法，构建AK动物模型。结果表明，相对于大鼠和小鼠而言，新西兰白兔具有低死亡率和角膜面积大等优点，更适合作为AK的模型动物。三种感染方式中，角膜刮伤和角膜接触镜所导致的感染具有较高的感染率，角膜病理变化与临床患者表现基本相符。

2AK的诊断

2.1　病原学诊断

2.1.1角膜刮片镜检

用角膜刮片刀在病变角膜进行取样。实验室常规染色方法包括吉姆萨(Giemsa)或革兰(Gram)染色、苏木素-伊红(HE)染色、Gomori银染(包囊壁呈黑色)、过碘酸席夫试剂(PAS)染色(包囊壁呈亮红色)和Galcofluor white染色(包囊呈苹果绿色)等[7]。 目前常用的方法为10%氢氧化钾湿封片检查。取角膜刮片材料、手术切除的角膜材料或棘阿米巴的培养物涂于或铺于载玻片上,加1滴10%KOH 溶液,倒置显微镜下检查。当查见棘阿米巴滋养体或具有双层囊壁结构的包囊时，即可确诊。此法具有快速简单，但常常不被患者所接受，同时由于临床医生对棘阿米巴认识不足或刮片部位和深度等影响，导致漏诊。

2.1.2角膜组织活体检查

切取的角膜病变材料,进行组织病理检查。 早期病变以中性粒细胞等炎性细胞浸润为主；中期角膜基质炎性坏死；晚期逐渐以瘢痕修复为主[8]。在病变组织中可见棘阿米巴属原虫的滋养体和包囊。 滋养体和包囊均呈紫红色或紫色,由于切面的不同,包囊一般呈卵圆形,多为双层壁,外壁有皱褶,内壁呈圆形、卵圆形或多边形；滋养体多为长条型，有伪足。当角膜溃疡达到基质层时,对角膜刮片检查呈阴性但又高度怀疑为AK的患者,角膜组织活体检查及微活体检查将有助于临床诊断。

2.1.3激光共聚焦显微镜

1985年激光共聚焦显微镜首次应用于角膜的观察。在共聚焦显微镜下，包囊具有典型结构，呈圆形至椭圆形，高回声,囊壁为双层,大小为25~150 μm,多为60 μm。共聚焦显微镜对活体角膜缘和角膜中央组织结构进行观察,为预后判断提供了新方法[9]。

2.1.4棘阿米巴分离与培养

将角膜刮取物或角膜病变组织，接种于含有大肠杆菌的琼脂培养基表面,37 ℃孵育2~5 d,倒置显微镜下观察虫体的生长情况,镜下可见棘阿米巴呈圆形或不规则形,形态随虫体移动而改变[10]。为了进一步鉴别虫种，可将琼脂培养基中的生长物接种于胰蛋白胨-酵母-葡萄糖(PYG)液体培养基中纯培养。数日后，培养瓶底部可观察到特征性的包囊和滋养体[11]，是AK确诊的可靠依据。

2.2　免疫学诊断

棘阿米巴属自由生活生物，普遍存在于自然环境。健康人接触阿米巴的机会多，因此大多数人群血清抗棘阿米巴抗体呈阳性反应,且AK患者泪液特异性IgA 抗体水平低于健康人。这增加了AK血清学检测的难度。目前，用Masson 三色免疫荧光技术(IFA)，经过抗原-抗体的联级放大反应，可使滴度1∶200的待检样品的终滴度达到1∶200，可确定棘阿米巴感染[12]。

2.3　分子生物学诊断

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)对AK早期诊断,尤其是虫种的鉴定具有重要的应用价值。目前常用的分子标记物主要包括18s rRNA和26s rRNA[10,13]。同角膜刮片和镜检相比，一般PCR验证的敏感性和特异性较差。近年来，实时定量PCR(realtime-PCR)技术开始应用于AK的诊断，其敏感可达到89.3%[14]。

目前已确认的棘阿米巴致病虫株共有6个，即A castellanii、A culbertsoni、A polyphaga、A hatchetti、A rhysodes和A griffini。除此之外，在自然环境中仍然存在着许多自由生的非致病性棘阿米巴虫株(free-living Ameoba,FLA)，同致病株之间具有相同的形态和PCR反应结果，因此常规的方法不能将其区分开。Kandori等[15-16]通过来自不同棘阿米巴虫株的57个18s rRNA序列进行比对，最终设计合成针对不同虫株的4对引物，对样本进行多重PCR定量分析。结果显示该方法具有较高的特异性、稳定性和敏感性，其检测的效率为81%，可以检测样本中单一阿米巴细胞的存在。

为提高定量诊断的准确性,Laummaunwai等[17]设计了一种加热法包囊DNA抽提技术。将样本加热至94 ℃，10 min，样本中包囊DNA释放出来。本法简单,经济，可大大提高实时定量PCR检测的效果。

此外，环介导等温扩增技术(Loopmediatedisothermal amplification，LAMP)是近年来发展起来的一种新型分子扩增技术[13]。针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在置换DNA聚合酶的催化下，63 ℃恒温反应30 min，即可得到扩增产物。与经典PCR相比，无需热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程，具有简单、快速、特异性强等特点。Yang等[10]以棘阿米巴致病株T4基因型的18s rRNA作为检测的分子标记物，采用LAMP法对含有不同DNA滴度的样本进行检测，具有高度敏感性和特异性。

2.4　核磁共振(1H nuclear magnetic resonance,NMR)

Bourcier 等[18]采用视网膜X 线断层技术进行角膜检查,发现在AK 患者的角膜上皮及基质内存在棘阿米巴滋养体和包囊，角膜内大量炎症细胞,因此该技术对于AK的形态学诊断和预后判定具有重要的意义。此后Hauber等[19]根据不同棘阿米巴虫株特有的染色特征对患者进行NMR成像检测。其检测的敏感性同传统的PCR技术相似，但此法快速，因此具有一定的临床意义。其诊断的准确性有待于进一步的试验研究。

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