·综述·

渗透压及弹性增强结合蛋白在椎间盘退变中作用的研究进展

林文波，曹鹏，杨晨，袁文

作者单位：200003上海，第二军医大学长征医院骨科

通信作者：袁文yuanwenspine@gmail.com

【关键词】椎间盘退行性变; 弹性蛋白; 转录因子; 渗透压

基金项目：上海市科委国际合作项目(13430721000)

作者简介：林文波(1990— )，硕士，医师

【中图分类号】R 341.31【文献标志码】 A

DOI【】

收稿日期：(2014-10-14)

随着中国人口的老龄化，颈椎病、腰椎椎间盘突出症等脊柱退行性相关疾病的发生率日趋升高，给人民群众造成了巨大的健康威胁和经济负担[1]。椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)是导致脊柱退行性相关疾病的主要病理基础，其发生机制较为复杂，至今尚无明确定论。IDD病理特点主要包括：髓核细胞数量减少和功能下降，细胞外基质成分改变，如蛋白聚糖、Ⅱ型胶原等大分子的合成减少，降解增加，渗透压下降，炎症细胞入侵等。在众多病理生理因素的综合作用下，椎间盘组织吸收、缓冲应力的能力下降[2]，发生纤维环变性破裂，椎间高度丢失，最终丧失生物学功能，导致椎间盘突出、脊柱不稳、神经根和脊髓病变及相应临床症状和体征[3]。

研究显示高渗透压具有促进髓核细胞外基质合成以及维持细胞功能及表型的作用[4]，而髓核细胞可以通过转录因子弹性增强结合蛋白(Tonicity Enhancer Binding Protein，TonEBP)系统调节细胞外基质合成，维持细胞内外的渗透压平衡。本文拟对椎间盘组织内高渗透压环境的生理学特点及其对髓核细胞的作用，以及TonEBP系统在细胞内环境稳态调节中的作用作一综述。

1髓核组织高渗透压微环境的生理特点

脊柱是人体的主要承载结构，其中椎间盘发挥着重要作用。当人体处于不同的活动状态时，椎间盘内的静水压也随之发生变化。椎间盘组织主要通过提高髓核组织的渗透压和调节髓核细胞外基质的水合状态来承受巨大的压缩应力[5]。因此，凝胶状的髓核组织就如同一个可以随时调节气压大小的气垫，发挥着缓冲作用。髓核细胞的细胞外基质由聚蛋白聚糖、Ⅱ型胶原等大分子构成。聚蛋白聚糖的组成成分包括250 kDa的核心蛋白、糖胺聚糖、硫酸软骨素以及硫酸角质素等，是髓核细胞外基质的主要成分[6]。聚蛋白聚糖的降解导致髓核组织吸附水的能力下降，进而引起椎间盘调节生物应力的能力下降并逐渐导致椎间高度丢失。

1.1髓核组织的渗透压形成机制

髓核组织细胞外基质中的聚蛋白聚糖分子上有大量带负电荷的糖氨聚糖侧链，这些侧链可与钠离子、钾离子等结合，从而形成髓核组织细胞外基质的高渗透压[7]。高渗透压使得髓核组织在高应力作用下仍能保持对水分子的吸附力。van Dijk等[8]研究显示,椎间盘内的渗透压值为430～496 mOsm/kg·H2O(1 mOsm/kg·H2O≈25.6667 kPa)不等。

1.2髓核组织的水合状态及渗透压调节

髓核组织中的含水量大约为77%，Wang等[9]曾用固液双相混合物来形容髓核组织的解剖形态。水分子在髓核组织中有结合型和游离型2种存在形式:结合型水分子反映聚蛋白聚糖以及胶原蛋白的电荷分布，游离型水分子的多少取决于组织的渗透压和静水压[10]。髓核组织的水合状态并非恒定不变，而是随着应力的变化而时刻改变的。椎间盘所受到的应力主要来自体重和肌肉活动，晚间休息时应力最低，为0.1～0.2 MPa；白天活动状态下椎间盘内压力最高可达3 MPa。在高应力作用下，髓核组织中的水就被挤出；到晚间应力下降时，又重新与聚蛋白聚糖结合。因此，细胞外基质的渗透压也就随着昼夜活动的变化而发生相应的改变[11]。

2高渗透压促进髓核组织细胞外基质的合成

Wuertz等[7]将人和牛髓核细胞分别在渗透压为300 mOsm/kg，400 mOsm/kg和500 mOsm/kg的培养基中进行离体培养，随着培养基渗透压的升高，髓核细胞聚蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达量逐渐上升，而Ⅰ型胶原的表达量则受到抑制。他们认为，高渗透压具有促进细胞外基质合成的作用，渗透压的降低可能是加快椎间盘退变进程的重要因素之一。Neidlinger-Wilke等[12]研究显示将培养基渗透压从300 mOsm/kg提高到500 mOsm/kg能增加聚蛋白聚糖的表达，而基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3, MMP-3)mRNA的表达量下降。MMP-3是髓核组织细胞外基质降解的主要酶类，是重要的基质金属蛋白酶之一，与椎间盘退变之间存在密切关系，能够降解蛋白多糖、层黏连蛋白、纤维连接蛋白等多种细胞外基质成分[13]。MMP-3还可激活其他潜在的各类MMPs，形成瀑布效应，加速椎间盘退变的进程[14]。

Spillekom等[15]研究髓核细胞在不同渗透压培养基中brachyury蛋白、聚蛋白聚糖以及糖胺聚糖的表达情况，结果表明当渗透压为400 mOsm/Kg时，brachyury蛋白、聚蛋白聚糖以及糖胺聚糖的表达量最高。其中Brachyury蛋白是髓核细胞的分子表型标记物之一[16]。

虽然各研究机构在髓核细胞体外培养的最适渗透压上没有达成统一，但是可以明确的是在一定范围内，高渗透压具有促进髓核细胞外基质合成和维持髓核细胞功能及表型的作用。

3髓核细胞通过转录因子TonEBP系统维持细胞内外的渗透压平衡

内环境稳态对于髓核细胞维持正常结构和生理功能非常重要，渗透压的改变可导致细胞内蛋白质和核酸的结构、功能发生改变，继而诱发细胞自噬、衰老甚至凋亡[17]。研究发现，细胞内环境渗透压改变后，髓核细胞发生了一系列适应性改变以防止其对细胞结构和功能产生损害[10]。近年来TonEBP在髓核组织渗透压调节中的作用受到关注。TonEBP又称为T细胞活化核因子5(nuclear factor of activated T cells 5，NFAT5)，是哺乳动物体内唯一已知的能由高渗透压激活的转录因子。TonEBP在髓核细胞调节渗透压的过程中发挥着重要作用[17]。

3.1髓核细胞通过TonEBP维持渗透压平衡

Tsai等[18]研究表明TonEBP在椎间盘髓核和纤维环组织中均有表达，且表达量较高。TonEBP激活后通过与目的基因的弹性反应增强子序列结合，促进目的基因的表达，从而调节渗透压，维持细胞内环境稳态。TonEBP的目的基因包括醛糖还原酶、γ-氨基丁酸转运蛋白、钠离子-肌醇转运蛋白以及牛磺酸转运蛋白等，TonEBP激活后可调节山梨醇、内铵盐、肌醇和牛磺酸等有机渗透溶质的跨膜转运，进而调节细胞胞浆的渗透压。TonEBP介导的渗透压调节与经典的渗透压调节方式(通过钠离子转运蛋白调节无机电解质离子的跨膜转运速率)相比，其优势在于：通过调节有机渗透溶质的跨膜转运，可实现在调节渗透压的同时不改变细胞膜电位，不影响细胞内各种酶和核酸等生物大分子的理化性质和功能结构。此外，该研究团队进一步研究发现，沉默TonEBP的表达后，髓核细胞在高渗环境中的细胞活力和增殖能力下降[19]。这一研究证明了高渗透压环境下，转录因子TonEBP在髓核细胞的生存和增殖过程中的确发挥着重要作用。

Gajghate 等[20]研究发现，在髓核细胞的细胞膜上有水通道蛋白-2(Aquaporin-2,AQP2)表达。AQP2是渗透压敏感的水通道蛋白，主要受精氨酸加压素调节，在肾脏集合管重吸收水的过程中发挥着重要作用。在髓核组织中，渗透压改变可通过激活TonEBP调控细胞膜上水通道蛋白AQP2的表达，调节水分子的跨膜转运和细胞外基质的水合状态，继而调节髓核细胞内外的渗透压平衡[21]。

3.2髓核细胞通过TonEBP调节细胞外基质的合成

除了维持髓核细胞内外渗透压平衡外，TonEBP在促进髓核细胞外基质的合成中也发挥着重要作用。

Tsai等[18]研究发现，聚蛋白聚糖的启动子序列中存在可与TonEBP结合的TonE共有序列。通过显性失活或者RNA干扰技术抑制TonEBP的表达后，聚蛋白聚糖的启动子活性显著降低，证明在髓核细胞中，TonEBP可以在转录水平调节细胞外基质的合成。

Hiyama等[22]研究发现，TonEBP可以调节β1,3-葡聚糖醛基转移酶-1(1,3-glucuronosyltransferase-1，GlcAT-1)的表达。该酶是糖氨聚糖合成的限速酶。糖氨聚糖是聚蛋白聚糖的主要结构，与核心蛋白及透明质酸结合后水化形成超分子结构，这一超分子结构所形成的流体力学调节系统在调节椎间盘的生物应力中发挥着重要作用。Hiyama等[23]进一步研究发现髓核细胞中骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)促进葡聚糖醛基转移酶的表达也是通过TonEBP介导的。

Mak等[24]报道成功构建2种TonEBP基因敲除的小鼠模型。然而，该模型目前存在围生期死亡率高等问题，这很大程度上限制了其在科学研究中的广泛运用。Wiig等[25]报道成功构建的TonEBPfl/fl 小鼠在一定程度上促进对TonEBP在椎间盘组织中调控机制的深入研究。

因此，笔者认为髓核组织中的高渗透压相关转录因子TonEBP能促进细胞外基质合成，维持细胞内外渗透压平衡，调节椎间盘生物应力，对髓核组织内环境稳态和生物学功能的维持具有重要意义。因此，可以认为是椎间盘退变的保护因素。

高渗透压是髓核细胞内环境的重要理化性质之一，在髓核细胞外基质的合成、细胞表型和功能的维持中发挥着重要作用。高渗透压相关转录因子TonEBP在髓核细胞中具有促进细胞外机制合成，维持内环境稳态等重要作用。因此，对髓核组织高渗透压微环境及转录因子TonEBP调控机制的进一步研究，将有利于阐明椎间盘退变的病理生理机制，并为脊柱退行性相关疾病的生物治疗提供新的方向和思路。

参 考 文 献

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(本文编辑于倩)