练 炼，慎晓明，周 冲，李 伟，陶 敏

（1.苏州市相城人民医院肿瘤科，江苏 苏州 215131，2.徐州市中心医院放疗科，江苏 徐州 221009；3.苏州大学附属第一医院肿瘤科，江苏 苏州 215006）

DPDmRNA及TSmRNA表达与进展期胃癌患者含替吉奥方案的化疗临床预后的关系

练 炼1，慎晓明1，周 冲2，李 伟3，陶 敏3

（1.苏州市相城人民医院肿瘤科，江苏 苏州 215131，2.徐州市中心医院放疗科，江苏 徐州 221009；3.苏州大学附属第一医院肿瘤科，江苏 苏州 215006）

目的 探讨二氢嘧啶脱氢酶(Thymidine phosphorylase，DPD)mRNA及胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase，TS)mRNA表达与进展期胃癌患者含替吉奥方案的化疗临床预后的关系。方法经病理学确诊的进展期胃癌患者40例，化疗前抽取外周血采用RT-PCR法检测DPDmRNA及TSmRNA表达水平，给予含替吉奥的方案：替吉奥+顺铂化疗。分析DPDmRNA及TSmRNA表达与进展期胃癌患者含替吉奥方案的化疗临床预后的关系。结果40例进展期胃癌患者中，至随访结束，40例患者中位OS为13.5个月，其中DPD低表达者为17个月，DPD高表达者为10个月，差异有显著统计学意义(χ2=4.059，P=0.044)。TS低表达者为17个月，TS高表达者为10个月，差异有显著统计学意义(χ2=3.936，P=0.047)。联合分析显示，DPD低表达且TS低表达的患者表现出更长的OS(χ2=17.486，P=0.001)。结论DPDmRNA及TSmRNA表达可单独或联合用于预测进展期胃癌患者对含替吉奥方案的预后。

DPD；TS；进展期胃癌；替吉奥

化疗目前仍是进展期胃癌的主要治疗手段。目前的研究表明化疗与最佳支持治疗相比，可明显改善进展期胃癌患者的生活质量，延长生存期。目前胃癌最常采用的化疗药物主要包括5-FU类、蒽环类、铂类和紫杉类、拓扑异构酶1抑制剂等。其中5-氟尿嘧啶类药物一直是胃癌化疗的基础用药。

二氢嘧啶脱氢酶(Thymidine phosphorylase，DPD)及胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase，TS)是5-FU代谢过程中的两个关键酶。二氢嘧啶脱氢酶(DPD)是5-FU类化疗药物的分解代谢的起始酶和限速酶。而胸苷酸合成酶(TS)是5-FU药物作用的靶酶。DPD决定了体内5-FU的有效浓度，而TS则决定5-FU药物化疗的敏感性[1]。但是5-FU临床使用时需静脉泵入，具有给药时间长、化疗毒性大等缺点，限制了其临床应用。

替吉奥是第三代氟脲嘧啶衍生物的口服制剂。替吉奥代谢后在血液中产生5-Fu的持续时间较长，其半衰期为(13.1±3.1)h，从而取得了与5-Fu持续静注类似的效果。替吉奥中OXO能够特异性抑制肠道黏膜细胞内乳清酸核糖转移酶的活性，阻断5-Fu的磷酸化，从而减轻胃肠道不良反应的发生[2]。由于替吉奥进入中国市场的时间不长，目前中国尚无有关二氢嘧啶脱氢酶(DPD)及胸苷酸合成酶(TS)与含替吉奥的方案的化疗预后研究方面的报道。故深入研究进展期胃癌患者的DPD mRNA及TS mRNA表达水平与含替吉奥方案化疗预后的关系具有重要的现实意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2010年6月至2011年6月期间在苏州市相城人民医院就诊，经病理学确诊的进展期胃癌患者40例，其中男26例，女14例，年龄45～78岁，中位年龄66.5岁。研究对象的纳入标准：经组织或细胞学证实的复发或转移性胃癌。年龄大于18岁；体力状态：KPS评分≥70分；预期生存期≥3个月；未接受过抗肿瘤治疗或术后辅助化疗，且距末次化疗6个月以上；目标病灶放疗者需要放疗结束后至少3个月；至少有一个可测量病灶(CT、MR的病灶面积至少10 mm×10 mm)；实验室检查结果：白细胞(WBC)≥4.0×109/L，中性粒细胞绝对计数(ANC)≥1.5×109/L，血小板(PLT)≥100×109/L。血清胆红素≤正常值上限，丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)在无肝转移情况下应≤正常值上限×2.5，如有肝转移≤正常值上限×5；尿素氮≤正常值上限×1.25，肌酐≤正常值上限×1.25。所有患者均在治疗前签署伦理之情同意书。

1.2 化疗方案及生存随访 含替吉奥的化疗方案：替吉奥+顺铂。替吉奥(维康达，鲁南制药集团山东新时代药业有限公司生产)用法：40 mg/m2，bid，d1～14，PO；顺铂用法：75 mg/m2，Ivgtt，d1，21 d为一个周期。随访采用门诊随访与电话随访相结合，终点为死亡，截止日期为2014年6月。随访时间截止时仍存活或失访的作为截尾数据。总生存期(Overall survival，OS)规定为从疾病诊断日到死亡时间或者随访截止时间，随访36个月。

1.3 外周血中DPD mRNA及TS mRNA的检测方法

1.3.1 实验标本 抽取患者外周血约7 ml，用EDTA-Na2抗凝，抽取mRNA并保存于-80℃冰箱中待测。

1.3.2 试剂和引物设计 Trizol(Invitrogen公司，美国)，逆转录试剂盒(Qiagen公司，上海)，PCR扩增试剂盒(上海生工，上海)，引物由primer premier5.0软件系统设计，引物序列如下：TS引物序列：5'-CTTCAGC GAGAACCCAGACC-3'，5'-TCCAGCCAACCCCTAAAGAC-3'，PCR产物长度192 bp；DPD引物序列：5'-AAACCAGTTCCACGTATAGC-3'，5'-AAACCAG TTCCACGTATAGC-3'，PCR产物长度501 bp。GAPDH引物序列：5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，5'-TGAGTCCTTCCAC-GATACC-3'，PCR产物长度为308 bp。

1.3.3 细胞总RNA的提取 在无菌条件下，将抗凝血用Ficoll-Hypaque法分离出有核细胞，用DEPC处理过的PBS液洗涤两次，然后取5×106细胞移入1.5 ml离心管中，再加1 ml Trizol，充分混匀，静置5 min后加入0.2 ml氯仿混匀，使用离心机在4℃、12 000 r/min离心15 min，将上清移入另一离心管中，加等体积异丙醇充分混匀，再使用离心机在4℃，12 000 r/min，离心15 min，弃去上清液，加1 ml用DEPC水配制成的75%乙醇洗涤。

1.3.4 cDNA合成 取0.5 ml容量离心管，置于冰浴上，加入10×反应缓冲液2 μl，用RNA酶抑制剂10 U，及10 mmol/L的dNTP混合物2 μl，再用Oligo (dT)180.5 mmol/L加入1 μl逆转录酶(4个单位)，加无RNA酶去离子水定容至20 μl，充分混匀，加入总RNA 50 ng～2 μg，混匀后离心3～5 s，放入42℃水浴1 h，在70℃水浴中10 min，转于冰上冷却，然后放置于-80℃冰箱中保存备测。

1.3.5 RT-PCR PCR的反应体系为25 μl，其中cDNA为1 μl，10×PCR缓冲液(Mg2+Plus)为2.5 μl，TaqDNA聚合酶为0.1 μl，4种dNTP混合物为2 μl，上下游引物各为1 μl，再用无RNA酶去离子水定容至25 μl。以β-actin为内参，然后与目的基因同管扩增。具体反应条件：95℃中预变性1 min，接着行40个循环，条件为：95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，30 s，最后72℃延伸10 min，最后于4℃保存。

1.3.6 PCR产物分析 使用厚度为4 mm的1%的琼脂糖凝胶(含EB 0.01 g/ml)，上样扩增产物5 μl，电压设为90 V/cm，电泳时间20 min，以2 000 bp的DNA Marker作为对照，利用培清凝胶成像系统摄像并分析PCR产物。使用Bio-Rad公司的Quantity One软件对结果进行灰度分析，用以判断目的基因的相对表达量，并且对PCR产物测序以证实其特异性。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，根据各组基因表达的平均数值将每组患者分为高表达组和低表达组。生存率的计算采用Kaplan-Meier方法，两组之间的生存差异使用Log-rank检验。取P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者特征 共有40例患者符合入选标准。患者的平均身体表面积为1.56 m2(范围：1.23～1.98 m2)。21例患者(52.5%)化疗前接受过胃大部切除术。腹腔淋巴结、肝转移灶为主要的可评价病灶。胃原发病灶及腹水为主要的不可评价病灶。使用RT-PCR法检测的40例患者的DPD mRNA和TS mRNA表达相对于β-actin的相对数值分别为(2.53±1.86)和(0.636±0.363)。取DPD和TS mRNA相对表达量分别以大于2.53和0.636为高表达。

2.2 DPD及TS mRNA表达与生存的关系 Kaplan-Meier生存曲线显示DPD及TS mRNA表达与OS的关系。40例患者中位OS为13.5个月，其中DPD低表达者为17个月，DPD mRNA高表达者为10个月，差异有显著统计学意义(χ2=4.059，P=0.044)。TS mRNA低表达者为17个月，TS高表达者为10个月，差异有显著统计学意义(χ2=3.936，P=0.047)。联合分析显示，DPD低表达且TS mRNA低表达的患者表现出更长的OS(χ2=17.486，P=0.001)，见图1。

图1 DPD及TSmRNA的表达与总生存期（OS）之间的关系

3 讨论

近年来，基于大量药物遗传学和药物基因组学方面的研究成果，已使肿瘤的个体化治疗在临床上的应用成为可能。由于传统的临床的参数和传统肿瘤组织病理学特征已经不再适合指导治疗方案的制定。通过肿瘤的个体化治疗提高疗效，减少无效药物毒副反应是临床肿瘤学追求的目标。相关肿瘤分子生物学领域的研究，已经发现了一些肿瘤特异性分子可以作为预测肿瘤患者预后的标志物[3]。

DPD是嘧啶类药物分解代谢的起始和限速酶Toriumi的研究发现DPD mRNA的表达水平与晚期胃癌患者的预后有显著相关性[4]。Matsubara等[5]的研究显示：DPD mRNA高表达是进展期胃癌的不良预后因素。本研究发现DPD mRNA低表达的患者具有更长的生存优势。

胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)是5-FU代谢途径的重要靶酶，其细胞内的含量及其活性的变化可以影响5-FU的抗肿瘤活性。许多研究发现TS基因的低表达可以预测患者有较好的生存预后[6]。Pullarkat等[7]的研究发现TS高表达的患者预后差。一项有关5-氟尿嘧啶(5-FU)mRNA表达途径基因个体化治疗研究发现：TS低表达的晚期胃癌患者有可能从S-1的治疗中获益且具有更长的生存期[8]。本研究发现TS mRNA表达越低患者且具有更长的生存优势。

进展期胃癌患者大多失去手术机会，肿瘤组织标本获取相对困难。本实验利用患者外周血检测DPD及TS mRNA表达，创伤小、具有可重复性、可行性高。本研究结果显示：DPD及TS mRNA表达与进展期胃癌患者的预后有关。且DPD及TS mRNA同时低表达的患者，生存期更长。当然，基于本研究的样本量有限，还需进行更多的检测方法及更多的样本量来发现更有价值的预后指标。我们的研究结果提示，DPD mRNA及TS mRNA表达可单独或联合用于预测进展期胃癌患者对含替吉奥方案的临床预后。

[1]Langer R,Specht K,Becker K,et al.Comparison of pretherapeutic and posttherapeutic expression levels of chemotherapy-associated genes in adenocarcinomas of the esophagus treated by 5-Fluorou-racil and cisplatin-based neoadjuvant chemotherapy[J].Am Society for Clin Pathol,2007,128(2):191-197.

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[3]Voon PJ,Kong HL.Tumour genetics and genomics to personalise cancer treatment[J].Ann Acad Med Singapore,2011,40(8): 362-368.

[4]Toriumi F,Kubota T,Saikawa Y,et al.Thymidylate synthetase (TS)genotype and TS/dihydropyrimidine dehydrogenase mRNA level as an indicator in determining chemosensitivity to 5-fluorouracil in advanced gastric carcinoma[J].Anticancer Res,2004,24 (4):2455-2463.

[5]Matsubara J,Nishina T,Yamada Y,et al.Impacts of excision repair cross-complementing gene 1(ERCC1),dihydropyrimidine dehydrogenase,and epidermal growth factor receptor on the outcomes of patients with advanced gastric cancer[J].Br J Cancer,2008,98(4): 832-839.

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Relationship between the DPD and TSmRNA expressions and the prognosis to S-1-based chemotherapy in patients with advanced gastric cancer.

LIAN Lian1,SHEN Xiao-min1,ZHOU Chong2,LI Wei3,TAO Min3.
1. Department of Oncology,Xiangcheng People's Hospital,Suzhou 215131,Jiangsu,CHINA;2.Department of Radiation Oncology,Xuzhou Central Hospital,Xuzhou 221009,Jiangsu,CHINA;3.Department of Oncology,the First Hospital Affiliated to Soochow University,Suzhou 215006,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore the relationship between the thymidine phosphorylase(DPD)and thymidylate synthase(TS)mRNA expressions and S-1-based chemotherapy prognosis in patients with advanced gastric can-cer(AGC).MethodsA total of 40 patients with pathologically confirmed AGC were enrolled in this study.Before the treatment,the expressions of DPD and TS mRNA in peripheral blood were determined using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Then the patients were administered with S-1-based regimen(S-1+cisplatin).The relationship between the DPD and TS mRNA expressions and prognosis in AGC patients were analyzed.ResultsThe median OS was 13.5 months in these 40 patients.It was 17 months in patients with low DPD mRNA expression and 10 months in those with high DPD mRNA expression(χ2=4.059,P=0.044).Also,it was 17 months in patients with low TS mRNA expression and 10 months in those with high TS mRNA expression(χ2=3.936,P=0.047).Pooled analysis showed that patients with both low DPD mRNA expression and low TS mRNA expression had even longer OS(χ2= 17.486,P=0.001).ConclusionThe detection of DPD and TS mRNA expression alone or in combination can be used to predict the prognosis inAGC patients.

DPD;TS;Advanced gastric cancer;S-1

R735.2

A

1003—6350（2015）06—0799—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.06.0287

2014-08-21)

练 炼。E-mail：doraemonlian@sohu.com