陈 冰，李玉梅，张立石，薛 欣，马雅銮

(中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

【实验研究】

益气活血法对缺氧损伤血管内皮细胞保护作用的研究*

陈 冰，李玉梅，张立石，薛 欣，马雅銮△

(中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

目的:观察以黄芪注射液和盐酸川芎嗪注射液联合用药为代表的益气活血法对缺氧损伤的血管内皮细胞的保护作用。方法:建立人脐静脉内皮细胞缺氧损伤模型，实验设对照组、模型组、黄芪组、川芎嗪组及联合用药组。采用MTT检测法、AnnexinV-FITC/PI双染结合流式细胞术凋亡检测法和ELISA检测法，观察药物对HUVEC增殖、凋亡和功能(分泌NO和ET)的影响。结果:与模型组比较，黄芪组和川芎嗪组及联合用药组均可不同程度地减轻缺氧对HUVEC的损伤，提高其生存率，降低其凋亡率，促进NO的分泌，抑制ET的分泌，两药联用比单用效果好。结论:益气活血法可通过促进增殖、抗凋亡及改善细胞分泌功能，有效减轻缺氧后血管内皮细胞的损伤。

益气活血法;人脐静脉内皮细胞;缺氧损伤;凋亡

冠心病属于中医“心痛”、“胸痹”范畴，病位在心，病机多为本虚标实，临床论治多采用益气活血、行气化痰、通阳开痹等方法。本研究观察以黄芪注射液和盐酸川芎嗪注射液联合用药为代表的益气活血法对缺氧损伤的血管内皮细胞的保护作用，并探讨其作用机理。

1 材料

1.1 药品与试剂

低糖DMEM、胎牛血清、肝素钠、内皮细胞生长因子购自美国Hyclone公司，内皮细胞生长因子购自瑞士ROCHE公司，MTT购自德国Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自美国BD公司，一氧化氮(Nitrogen monoxidum，NO)测定试剂盒、内皮素(Endothelin，ET)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。黄芪注射液购自正大青春宝药业有限公司(批号1409021)，盐酸川芎嗪注射液购自哈尔滨三联药业有限公司(批号120201A1)。

1.2 仪器

IX-70倒置显微镜:日本Olympus公司，FACS Callibur流式细胞仪:美国BD公司，Multiskan酶标仪:美国Thermo公司，3K15高速低温离心机:德国Sigma公司，-80℃低温冰箱:美国Thermo公司。

2 方法

2.1 人脐静脉内皮细胞的培养

取健康胎儿脐带以PBS反复冲洗脐静脉，注入0.1%Ⅱ型胶原酶，两端以止血钳夹住，37℃消化20 min，收集消化液离心。以内皮细胞培养液(低糖DMEM，20%胎牛血清，10 μg/mL内皮细胞生长因子，10 U/mL肝素钠)重悬细胞，接种于培养瓶中。待细胞长成融合状态进行形态学鉴定和免疫组化鉴定(Ⅷ因子相关抗原抗体阳性，纯度大于99%)，第3～5代细胞用于实验。将细胞分成对照组、模型组、不同浓度黄芪组、不同浓度川芎嗪组和联合用药组(黄芪注射液+盐酸川芎嗪注射液)。

2.2 血管内皮细胞缺氧损伤模型的建立［1］

取HUVEC传代于相应的培养器皿中，培养24 h后长成致密单层，把培养液换成含相应浓度药物的PBS，放置于缺氧罐(温度37℃，100%氮气)中4 h造成细胞缺氧损伤模型，再换成含相应浓度药物的普通培养液(低糖DMEM，10%胎牛血清)复氧培养24 h或者48 h，分别收集细胞及上清用于指标检测。

2.3 指标检测

2.3.1 黄芪注射液和盐酸川芎嗪注射液对正常HUVEC的影响 将细胞以5000/孔的密度接种于96孔板中，待24 h后加入不同浓度的黄芪注射液和盐酸川芎嗪注射液，作用48 h后，MTT法检测药物对HUVEC存活率的影响。

2.3.2 药物对缺氧损伤HUVEC存活率的影响 以5000/孔的细胞密度将HUVEC接种于96孔板中，按照(2.2)方法造模后并给予药物处理，作用48 h后，MTT法检测药物对缺氧损伤HUVEC存活率的影响。

2.3.3 药物对缺氧损伤HUVEC凋亡的影响

以2×104/孔的细胞密度将HUVEC接种于6孔板中，按照方法(2.2)造模并给予相应药物处理，作用24 h后，收集细胞采用Annexin V-FITC/PI结合流式细胞仪检测细胞早期和晚期的凋亡率。

2.3.4 药物对缺氧损伤HUVEC分泌功能的影响 实验方法同2.3.3，作用24 h后收集细胞上清，ELISA法检测药物对NO、ET的影响。

2.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 11.5进行统计，实验数据结果以均值±标准差(±s)表示，α=0.05，数据经过正态性检验和方差齐性检验后，进行单因素方差分析和两两比较的统计学分析。

3 结果

3.1 黄芪注射液对正常HUVEC存活率影响

表1显示，400 μg/mL剂量的黄芪注射液对正常HUVEC增殖的促进作用为10.95%，统计学差异显著;其余剂量均无明显的促进增殖作用，因此选用400 μg/mL剂量用于后续实验。

3.2 盐酸川芎嗪注射液对正常HUVEC存活率的影响

表2显示，60 μg/mL及以上剂量的盐酸川芎嗪注射液对正常HUVEC的增殖有抑制作用，统计学差异显著;15 μg/mL和30 μg/mL剂量的盐酸川芎嗪注射液无明显的抑制增殖作用，因此选用15 μg/ mL的剂量用于后续实验。

表1 黄芪注射液对正常HUVEC存活率的影响(±s)

注:与0剂量组比较:*P＜0.05

剂量(μg/mL) 例数 存活率(%) 0 100.00 4 6 99.53±4.36 6 40 6 101.24±5.23 400 6 110.95±5.69*1000 6 101.43±5.39 2000 6 99.74±4.77

表2 盐酸川芎嗪注射液对正常HUVEC存活率的影响(±s)

表2 盐酸川芎嗪注射液对正常HUVEC存活率的影响(±s)

注:与0剂量组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

剂量(μg/mL) 例数 存活率(%) 100.00 15 6 98.70±2.48 30 6 97.41±2.21 60 6 92.04±1.18*120 6 88.21±5.96*240 6 74.89±5.49 0 6＊＊

3.3 不同药物对缺氧损伤HUVEC存活影响

表3显示，与模型组比较，黄芪组、川芎嗪组及联合用药组均可显著提高缺氧损伤HUVEC的存活率(P＜0.01);联合用药组作用最强，与黄芪组及川芎嗪组比较差异有统计学意义(P＜0.01);黄芪组作用次之，与川芎嗪组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3 药物对缺氧损伤HUVEC存活的影响(±s)

表3 药物对缺氧损伤HUVEC存活的影响(±s)

注:与模型组比较:＊＊P＜0.01;与黄芪组比较:△△P＜0.01;与川芎嗪组比较:☆☆P＜0.01

组别 例数 存活率(%) 100.00模 型 组 6 18.77±2.30黄 芪 组 6 35.84±2.25＊＊川 芎 嗪 组 6 23.08±1.83＊＊△△联 合 用 药 组 6 48.00±3.94对照组6＊＊△△☆☆

3.4 不同药物对缺氧损伤HUVEC凋亡影响

表4显示，HUVEC缺氧损伤后，模型组早期和晚期凋亡率分别为21.74%和11.78%，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，黄芪组可降低HUVEC凋亡率(P＜0.05)，联合用药组可显著降低HUVEC凋亡率(P＜0.01)。联合用药组作用强于黄芪组，与黄芪组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。川芎嗪组对凋亡率无明显作用。

表4 药物对缺氧损伤HUVEC凋亡的影响(±s)

表4 药物对缺氧损伤HUVEC凋亡的影响(±s)

注:与模型组比较:*P＜0.05;＊＊P＜0.01;与黄芪组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与川芎嗪组比较:☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

组 别例数早期凋亡率(%)晚期凋亡率(%)总凋亡率(%) 6 2.96±0.67 2.14±0.33 5.10±0.86模 型 组 6 21.74±3.93 11.78±2.90 33.51±3.14黄 芪 组 6 17.24±2.31* 8.63±1.41* 25.87±3.23*川 芎 嗪 组 6 20.32±2.72 10.03±1.84 30.35±3.67△联合用药组 6 12.18±1.24＊＊△△☆☆ 6.42±1.14＊＊△☆☆ 18.60±1.85对照组＊＊△△☆☆

3.5 不同药物对缺氧损伤HUVEC分泌功能的影响

表5显示，各组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。川芎嗪组及联合用药组均可显著促进HUVEC分泌NO，抑制HUVEC分泌ET，与模型组比较差异有统计学意义。黄芪注射液组仅对NO的分泌有改善(P＜0.05)，川芎嗪组促进NO的分泌作用强于黄芪注射液组(P＜0.05);联合用药组对HUVEC分泌NO和ET功能的改善作用最强，与黄芪组、川芎嗪组比较差异有统计学意义。

表5 不同药物对缺氧损伤HUVEC分泌NO和ET影响(±s)

表5 不同药物对缺氧损伤HUVEC分泌NO和ET影响(±s)

注:与模型组比较:*P＜0.05;＊＊P＜0.01;与黄芪组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与川芎嗪组比较:☆P＜0.05，☆☆P＜0.01

组 别 例数 NO(μmol·mL-1) ET(pg·mL-1) 6 95.02±7.46 38.14±4.40模 型 组 6 27.40±5.77 67.38±6.50黄 芪 组 6 36.87±6.82* 62.49±3.53川芎 嗪 组 6 45.67±5.96＊＊△ 54.60±2.51＊＊△△联合用药组 6 55.81±7.47＊＊△△☆ 48.70±3.51对照组＊＊△△☆☆

4 讨论

血管内皮细胞为衬贴于血管腔面的单层扁平上皮细胞，它沿着血管内壁单层有序排列，直接与血液的各种成分相接触，是血液、血流和血管三者相互联系的界面和环节。研究表明，内皮具有多种生理功能，参与机体的血管调节、凝血、纤溶、免疫、物质转运和生物活性物质释放等生命活动。血管内皮细胞损伤尤其内皮细胞凋亡是冠状动脉粥样硬化发生的早期事件，在冠心病的形成和发展中起重要作用［2］。内皮细胞能合成和分泌多种血管活性物质，如NO、ET等。NO对血管有扩张作用，ET对血管有收缩作用，正常情况下二者保持动态平衡，NO的作用略占优势，以保持血管壁的平滑和血流的通畅。内皮细胞受到损伤时，NO和ET之间的动态平衡受到破坏，NO生成量下降，ET表达量增加，导致微血管痉挛并阻塞血流。研究表明，保护内皮细胞、改善其生存状态以及恢复其生理功能，对于防治冠心病有着重要的作用和意义［3-4］。

中医认为冠心病其病位主要在胸和心脉。胸在上焦，位属于阳，为清阳所聚之处，内藏心肺，为气血活动的源泉;心主血脉，血赖心脉的活动而运行全身以起濡养作用。若阳气不足则血脉运行失畅，心脉瘀阻;心脉瘀阻则阴血不足，心失所养，变生冠心病诸证。益气活血法的立法源于《素问·阴阳应象大论》有“定其血气，各守其乡，血实者宜决之，气虚者宜掣引之”的论述。“方从法出，法随证立”，气虚血瘀证是冠心病最常见的证候，所以益气活血法是冠心病的重要治法。补阳还五汤出自清代医家王清任的《医林改错》，所治之证系由中风后气虚不能推动血行、气虚血瘀，导致半身不遂、口眼歪斜等症状。补阳还五汤是益气活血法的经典方剂。方中重用生黄芪以大补肺脾胃之气使气血旺盛;配合少量的当归尾、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花多种活血祛瘀药逐瘀通络，之所以用大剂量黄芪为主药的目的，就是以补气行血通络。

本研究在探讨益气活血法对内皮细胞保护作用的实验中，取法于补阳还五汤之方义，选用大剂量的黄芪注射液和小剂量的盐酸川芎嗪注射液联合用药。实验中发现，二者联用后可抑制缺氧损伤内皮细胞的凋亡，差异有统计学意义;可促进内皮细胞分泌NO，并抑制其分泌ET，从而发挥舒张血管的作用;联合用药的效果强于单用黄芪注射液和盐酸川芎嗪注射液。

此外，本研究在实验中也发现，单用黄芪注射液有明确的保护内皮细胞的作用，但对改善内皮细胞分泌功能的效果略差，与文献报道一致［5-6］。单用盐酸川芎嗪注射液，大剂量的盐酸川芎嗪注射液对正常的内皮细胞有毒性，小剂量的盐酸川芎嗪注射液也有保护内皮细胞的作用，功效不如黄芪注射液，但对改善内皮细胞分泌功能效果优于黄芪注射液。

临床病证往往错综复杂，单药应用往往难以收到满意的效果，联合用药是临床的必然趋势。黄芪注射液和盐酸川芎嗪注射液均为临床常用的中药注射液制剂，其有效性和安全性已经过多年的实验室和临床验证，临床也时常两药联用［7-8］，但一直缺少联用的实验室研究。希望本研究的结果能为益气活血法的治法以及黄芪注射液和盐酸川芎嗪注射液的联合用药提供些许实验室依据。

［1］陈冰，李毅，商悦.葛根素对缺氧损伤的大鼠脑微血管内皮细胞凋亡和功能的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15 (4):72-79.

［2］韩学杰，沈绍功.探讨血管内皮损伤致冠心病心绞痛的发生机理［J］.中国中医基础医学杂志，2001，7(4):23-25.

［3］Yun-fei Liao，Yong Feng，Lu-Lu Chen，et al.Coronary heart disease risk equivalence in diabetesand arterialdiseases characterized by endothelial function and endothelial progenitor cell［J］.Journal of Diabetes and its Complications，2014，28 (2):214-218.

［4］俞庆三，李平.阿魏酸钠对冠心病的疗效及其对血管内皮功能的保护作用［J］.中国生化药物杂志，2012，22(3):480-482.

［5］杨富国，董果雄，张社华.黄芪注射液对内皮细胞缺氧复氧损伤的保护作用［J］.中国微循环，2004，8(3):136-139.

［6］涂春香，谢佐福，陈江荣，等.黄芪注射液对烟碱损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用［J］.福建中医药大学学报，2011，21 (4):19-20.

［7］梁同衍，刘侠.黄芪注射液联合川芎嗪注射液对早期糖尿病肾病患者尿白蛋白排泄率及C反应蛋白的影响［J］.中国药物经济学杂志，2014，21(9):194-196.

［8］李乙根.黄芪注射液联合川芎嗪注射液治疗冠心病不稳定型心绞痛46例临床观察［J］.新中医，2008，40(6):35-36.

Protective Effect of Supplementing Qi and Activating Blood Circulation Method on Vascular Endothelial Cells in Hypoxia Injury

CHEN Bing，LI Yu-mei，ZHANG Li-shi，XUE Xin，MA Ya-luan△
(Institute of Basic Theory of TCM，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:To observe effects of the combination of astragalus injection and ligustrazine injection，which is used as the representative of Yiqi Huoxue method，on the protection of Human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs)in anoxia injury.Methods:HUVEC were intervened with astragalus injection，ligustrazine injection or the combination，then these cells were treated with 100%nitrogen for 4 hours as the anoxia injury.Proliferation of HUVECs were detected by MTT.Apoptosis of HUVECs were analysed by AnnexinV-FITC/PI staining with flow cytometry.And the function of HUVEC by secretion of NO and ET were detected by ELISA.Results:Compared with model group，astragalus group，ligustrazine group and the combination group all can reduce the anoxia damage on HUVECs in different extent，by increasing the survival rate，decreasing the apoptosis rate and improving NO levels and lowering ET levels.Combination group works best in all groups.Conclusion:Yiqi huoxue method can effectively reduce the anoxia injury on HUVECs by improving their proliferation，inhibiting their apoptosis and improving their functions by regulating the secretion of NO and ET.

Yiqi Huoxue method;Human umbilical vein endothelial cells;Anoxia injury;Apoptosis

R543

:B

:1006-3250(2015)07-0794-03

2015-02-17

中国中医科学院自主选题研究项目(YZ-1408);中国中医科学院自主选题研究项目(YZ-1407)

陈 冰(1975-)，女，辽宁盘锦人，助理研究员，药学博士，从事证候物质基础及方证相应研究。

△通讯作者:马雅銮(1968-)，女，福建宁德人，研究员，医学博士，从事中药抗炎机制相关研究，Tel:010-64014411-2505，E-mail:yaluanma@163.com。