李 耿, 刘晓志, 王志明, 高 健

华北制药集团新药研究开发有限责任公司, 抗体药物研制国家重点实验室, 石家庄 050015

双特异性抗体药物应用进展

李 耿, 刘晓志, 王志明, 高 健*

华北制药集团新药研究开发有限责任公司, 抗体药物研制国家重点实验室, 石家庄 050015

基因工程的飞速发展推动了新型双功能抗体药物的成功研制。目前双功能抗体药物主要应用于肿瘤的免疫治疗、自身免疫疾病和感染类疾病的治疗，在组织再生和临床诊断领域也有应用。就双特异性抗体的发展史进行了简要回顾，对其在免疫治疗、组织再生和临床诊断等领域中的应用进展进行了综述，并展望了未来的发展方向，以期为新型双特异性抗体药物的研制提供参考。

BiTE(T-细胞的双特异抗体)；双特异性抗体；免疫治疗；组织再生

1997年，双特异IgG样抗体的概念被提出，Coloma等[1]将具有不同结合特异性的单链区连接到IgG重链的C末端，和通常意义上的抗体分子不同，他们具有双重的结合功能。最初由于技术障碍，导致双特异抗体仅用于科学研究。然而，随着技术的飞速进步, 极大地促进了工程、生产和重组蛋白衍生品的发展，双特异抗体的研究被重新激活。至今，用于治疗的各种双特异抗体处于研发的不同阶段。近年来，双特异性抗体在肿瘤免疫治疗方面和组织再生领域取得了不容忽视的成就。本文介绍了双特异性抗体的发展历程及其类型，并综述了双特异性抗体在免疫治疗、组织再生和临床诊断中的应用，以期为双特异性抗体药物的研发提供参考。

1 双特异性抗体的概况

1.1 双特异性抗体的发展历程

1961年，Nisonoff 和 Rivers[2]将不同特异性的两个单价抗体制剂进行氧化重组得到了双特异性抗体，第一次对双特异性抗体进行了描述。1975年，杂交瘤技术建立，该项技术可用于生产具有预期特异性的单克隆抗体。20世纪80年代，Milstein研究团队发现，将两个不同杂交瘤同体细胞融合杂交，可以用于杂交双特异性分子的生产。通过体细胞杂交产生的多种抗体用于肿瘤的免疫治疗，例如，用于富集效应细胞靶向肿瘤细胞的进攻。双特异性抗体药物开始在治疗中得到应用，这种抗体可以富集效应性T细胞靶并进攻肿瘤细胞[3]。但终因临床试验中的效率低、免疫原性和严重不良反应等，没有达到预期效果。这些缺点曾一度导致20世纪90年代人们对这一类分子丧失了兴趣。

两个抗体分子间的偶联是通过化学或生物学方法实现的，如化学偶联或基因重组。之前的策略主要集中在使用双特异性抗体片段，例如Fab抗体分子的设计策略，利用人源化和全人源抗体进行化学偶联生产双特异性抗体，而不是使用基因工程生产[4]。之后的分子连接策略是使用基因工程生产重组的双特异性抗体，包括如缺失恒定区的小型双特异性抗体和包含恒定区的IgG样双特异性抗体。基因重组的分子设计有较大的自由性，例如调节分子大小和结合价。随着抗体工程和新技术的发展，在21世纪初，有关双特异性抗体的研究被重新启动[5]。除了用于癌症免疫治疗中的效应细胞富集，双特异性抗体还被用于放射免疫治疗，以及攻击两个疾病相关的双靶向策略。现代的基因工程可以设计生产具有特定组成的重组双特异性抗体药物，并具有更好的稳定性。因此，制药领域恢复了对双特异性抗体研究的兴趣，同时许多公司也建立了研究计划。2009年批准用于治疗恶性腹水的第一个双特异性抗体药物上市，用于富集效应细胞并靶向EpCAM阳性的肿瘤细胞。随后，越来越多的双特异性抗体药物进入临床和临床前研究。

1.2 双特异性抗体的类型

之前的研究已经证实了多种类型的双特异性抗体具有很好的临床应用前景。随即引发了制药公司极大的兴趣，罗氏公司、辉瑞制药、基因泰克、赛诺菲、艾伯维、日本中外制药和安进公司等都在进行双特异性抗体药物的研发。最初，将两个纯化的单克隆抗体化学合成为一个双特异性抗体分子，或者通过融合两个杂交瘤细胞生产双特异IgG分子。在过去的二十年中，基因工程设计了50多种不同结构类型的双特异性抗体分子用于药物研发[6]。这些都给双特异性抗体分子的治疗和诊断应用带来了革命性的发展，并可以使研究者调整药物分子的大小、化合价、半衰期和双特异性抗体分子的生物分布等，以满足靶向药物的特殊要求。一般来说，双特异性抗体可以分为两种主要的类型，带有Fc片段的类型和缺少Fc片段的类型，后者通常小于IgG和IgG样的双特异性抗体分子。

制备带有Fc片段的双特异性抗体可以利用纯化IgG的既有方法，同时也具有较好的溶解性和稳定性。此外，Fc片段的存在也有利于一些生物效应的实现，例如细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)和补体结合(complement fixation，CDC)效应等，并且因其分子量大和FcRn介导的循环过程还可以增加其半衰期[7]。通过进一步的基因工程改造也可以实现一些其他性质，例如消除ADCC或CDC效应，但同时保留其长半衰期的属性。

相比之下，缺少Fc片段的双特异性抗体，完全依赖其与抗原结合发挥治疗作用。在同一个表达细胞中，可以实现双特异性抗体IgG分子的不同重型链和轻型链的表达和组装。缺少Fc片段的双特异性抗体，因其分子小，很容易被机体清除，需要频繁注射。但其体积小，有利于组织渗透用于肿瘤治疗。通过结合聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，或使用拟PEG多肽或白蛋白也可以实现半衰期的延长。

2 双特异性抗体在医学中的应用

2.1 双特异性抗体在免疫治疗中的应用

抗体应用是一个完善并迅速增长的药物市场，至少有45个以抗体为基础的产品在市场上销售，2013年全球销售总额达630亿美元。抗体药物临床和商业的巨大成功，极大的刺激了包括双特异性抗体在内的下一代抗体药物的研发。

当前研发的连接细胞毒性T-细胞的双特异性抗体药物被称为BiTE(bispecific T cell engager)，特异结合CD3阳性T细胞的BiTE药物在恶性疾病的动物模型和人类临床试验中证实了它的有效性[8]。对于肿瘤治疗，利用患者自身的免疫系统攻击肿瘤细胞的策略，较当前的化疗具有明显优势。但是，这种策略因为特定的细胞毒性T淋巴细胞数量有限，限制了其抗肿瘤作用的发挥。起初人们使用淋巴因子激活的杀伤细胞或肿瘤浸润淋巴细胞来进行免疫治疗，但是收效甚微。后来，在进行细胞免疫治疗前，将T细胞体外扩增到3×1011个细胞，再将T细胞和BiTE抗体一起输入病人体内。免疫效应细胞和BiTE抗体在体外的孵育组装，可以提供大量具有靶向的效应细胞并有效降低游离的抗体量。BiTE抗体设计目标是细胞依赖激活T细胞和临时性激活T细胞并溶解癌细胞。此外，同时结合CD3和EGFR的BiTE药物，可以克服单独使用西妥昔单抗的一些限制。

工程化的双特异性抗体开辟了许多潜在治疗应用的药物研究，双特异性抗体药物时代即将到来。现被批准用于治疗的双特异性抗体药物有catumaxomab(Removab ©，抗EpCAM和抗CD3)和blinatumomab(Blincyto ©，抗CD19和抗CD3)，另有30余种的双特异性抗体药物处于临床开发阶段。这些双特异性抗体药物用于富集T细胞杀伤肿瘤细胞，但多数药物用于介导两种不同疾病靶点如细胞表面受体、可溶性配体及其他蛋白间的相互作用。利用抗体的模块化结构设计的双特异性抗体药物超过了60种，这其中的双特异性抗体药物具有不同属性，如分子量、抗原结合位点的数目、不同结合位点之间的空间关系、单一抗原效价、支持二次免疫功能和药代动力学的半衰期等。这些具有不同属性的药物，可以用于满足临床药物的不同使用需求。

还有一些双抗体药物用于非癌症治疗，如自身免疫疾病等。正如癌症的治疗，往往寻求两个独立靶点的“共簇效应”，而不是简单的靶向两个独立的疾病相关蛋白。Xencor公司的XmAb5871(处于Ⅱ期临床)，用于结合CD19(B细胞受体辅助蛋白)和CD32B(B细胞的抑制性受体)。因为B细胞受体触发CD32B介导的负反馈调节机制，抑制人体的免疫系统功能，可用于治疗自身免疫性疾病。利用两个单抗的简单结合药物，则不会产生这种受体间的“共簇效应”。双特异抗体药物较一般抗体具有的优势是抗体亲和力。 “亲和力假说”认为，双特异抗体药物更适合结合同一个细胞上的两个靶点，而一般抗体则会导致结合的混乱。同时，治疗自身免疫性疾病的挑战是需要长期治疗，因此对药物安全和有效性的要求更高[9]。因此，在同等条件下，双特异抗体药物更安全有效。

受体酪氨酸激酶(RTK)，如Her蛋白家族成员、胰岛素样生长因子受体、肿瘤细胞的生长刺激或调节蛋白。如在癌症治疗中使用的靶向HER1的Cetuximab (Erbitux©) 和Panitumumab (Vectibix©),及靶向HER2的Trastuzumab (Herceptin©) 和 Pertuzumab (Perjeta©)。然而，一个信号通路阻滞会导致另一个信号通路的切换，通过这种方式癌细胞可以解除信号通路的生长抑制。但是双特异抗体药物可以同时干扰两个(或更多的)RTK信号通路，从而减少这种逃逸机制的可能，可有效提高疗效。针对参与炎症途径的受体或配体，可以使用类似方式阻断促炎症信号，用于治疗炎症或自身免疫性疾病。

2.2 双特异性抗体在组织再生中的应用

对于组织再生和肿瘤治疗，细胞疗法是一个潜在的策略。对于组织再生，干细胞需要靶向到达受损区域进行修复；而对于肿瘤治疗，细胞毒性T细胞也需要定向到达肿瘤细胞，再对肿瘤细胞进行清除。例如，双功能抗体同时识别位于T-细胞和肿瘤细胞上的抗原，这样就在空间上将两者间接连在一起，进而完成了T-细胞对肿瘤细胞的溶解。双功能抗体同时具有两个不同单克隆抗体的性质，使其具有了许多潜在的应用可能。

干细胞移植修复心脏的疗效受到经迁移、灌输、增殖到损伤心肌部位的干细胞数目的限制。为了解决这个问题，Lum等[10]研究了双特异性抗体的造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)是否靶向修复受损的心肌。移植骨髓中纯化得到CD34阳性细胞使治疗效果得到明显改善。该团队构建的双特异性抗体可以选择性的同CD45和肌球蛋白轻链-1(myosin light chain-1，MLC-1)相结合，CD45表达在CD34+HSC细胞上，而MLC-1是肌细胞内执行肌细胞收缩的基本结构，当肌细胞缺血性损伤时就暴露在细胞膜上；MLC-1可以被认为是心肌损伤的生物标志物。

此外,Zhao等[11]的一项研究表明，使用结合有双特异性抗体的CD34阳性细胞可以定位在小鼠心肌缺血的梗死部位。这种定位可以改善心室功能，增强血管生成和减少纤维化。此外，这种注射还可以避免心肌重构的风险，结合双特异性抗体的CD34阳性细胞，不仅可以增加CD34阳性细胞的数量，还可以改善左心室组织的功能。

2.3 双特异性抗体在临床诊断中的应用

除了在治疗领域的应用，双特异抗体药物因其高度敏感性和特异性，被用于感染性疾病和癌症的临床诊断或医学影像等。用于检测的双特异抗体药物，其中的一个结合域同被检测病原体、病毒或肿瘤细胞结合，另一结合域同根过氧化物酶或碱性磷酸酶结合。这增加了方法的灵活性并且可以一步完成，无需预先抗体标记。双特异性抗体的肿瘤成像可以两步完成，使用双特异性抗体对肿瘤细胞进行预标记，再注射放射性同位素成像。这种方法与放射性同位素标记抗体成像相比，特异性、灵敏度更好，并且背景信号低，这是因为未结合的放射性同位素可以被迅速清除。双特异性抗体可以同时结合特定抗原和检测部分的能力，使他们成为检测分析中具有双功能免疫能力的优良探针。同传统单克隆抗体相关的优势包括：设计灵活，一步法替代传统的多步操作；避免了对试剂(如二抗等)的标记，降低了修饰酶或抗体的化学危害；抗体被应用于各种不同的免疫诊断检测平台，如：微孔板、棒、条、滤盘和旋转盘型的分析系统中。因为简化了检测步骤，双特异性抗体已经应用于上述检测中。双特异性抗体当前被应用于开发简单、快速和高度敏感的细菌病毒感染及癌症诊断等。

3 展望

处于临床研究阶段的双特异性抗体主要集中在癌症治疗和组织再生领域。主要目标是同时解决处于病理生理过程的不同靶点，从而提高治疗效果。其他需要解决的重要方面是，确定最优应用模式和调节PK属性，尤其是小型双特异性抗体分子。在使用BiTEs药物时，需要使用静脉注射的方式控制血药浓度。通过PEG化或白蛋白绑定的策略可以延长药物的半衰期。在癌症治疗中，双特异性抗体用于将免疫效应细胞重新定位到破坏肿瘤细胞(癌症免疫疗法)，或通过受体或配体失活和两个不同的信号级联。越来越多的新策略融入双特异性抗体药物的研发，越来越多的双特异性抗体药物进入临床试验，可能很快就有新的药物被批准上市。双特异性抗体药物的终极目标是作为制剂(如药物、效应细胞)和靶标(如肿瘤、组织损伤)之间的链接，BiTE药物是高效并具有代表性的一类免疫治疗药物。

2014年12月FDA批准的安进公司生产的Blinatumomab是第一个BiTE类药物，用于急性淋巴细胞白血病的治疗。国内的双特异性抗体研究也取得了很多成果，郭宁教授[12]成功构建了抗HER2 与CD16 的双功能抗体；李博华等[13]利用Trastuzmab和Pertuzumab可变区构建的双功能抗体，能够有效抑制ErbB2 的异二聚体化，该抗体对于Trastuzumab 耐药株治疗有效；寇庚等[14]构建了靶向VEGF和骨桥蛋白的双特异性抗体；张大鹏等[15]构建了可同时结合VEGF-A和VEGF-C的双特异性抗体，均能有效抑制肿瘤血管新生，在体内显示出较好的抑瘤效果；张涛等[16]研发的双特异性抗体，能同时结合人体内结直肠癌细胞靶点CD133和人体T细胞CD3靶点，动物实验研究显示其能够显著抑制高表达CD133肿瘤细胞的生长，并能促进其凋亡。在未来，双特异性抗体必将在肿瘤免疫治疗、组织再生、临床检测等领域中发挥重要的作用。在设计构建结构更为简单稳定的双特异性抗体、选择高效表达系统、寻求更简化的生产步骤等方面仍需继续努力探索。

[1] Coloma M J, Morrison S L. Design and production of novel tetravalent bispecific antibodies[J]. Nat. Biotechnol.,1997,15(2):159-163.

[2] Nisonoff A, Rivers M M. Recombination of a mixture of univalent antibody fragments of different specificity[J]. Arch. Biochem. Biophys.,1961,93:460-462.

[3] Zou J, Chen D, Zong Y,etal.. Immunotherapy based on bispecific T-cell engager with hIgG1 Fc sequence as a new therapeutic strategy in multiple myeloma[J]. Can. Sci.,2015,106(5):512-521.

[4] Wu X, Sereno A J, Huang F,etal.. Fab-based bispecific antibody formats with robust biophysical properties and biological activity[J]. mAbs,2015,7(3):470-482.

[5] Moore G L, Bautista C, Pong E,etal.. A novel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens[J]. mAbs,2011,3(6):546-557.

[6] Kontermann R E. Dual targeting strategies with bispecific antibodies[J]. mAbs,2012, 4(2):182-197.

[7] Zeng J, Liu R, Wang J,etal.. A bispecific antibody directly induces lymphoma cell death by simultaneously targeting CD20 and HLA-DR[J]. J. Can. Res. Clin. Oncol.,2015,141(11):1899-1907.

[8] Osada T, Patel S P, Hammond S A,etal.. CEA/CD3-bispecific T cell-engaging (BiTE) antibody-mediated T lymphocyte cytotoxicity maximized by inhibition of both PD1 and PD-L1[J]. Can. Immunol. Immunother., 2015,64(6):677-688.

[9] Sun L L, Ellerman D, Mathieu M,etal.. Anti-CD20/CD3 T cell-dependent bispecific antibody for the treatment of B cell malignancies[J]. Sci. Transl. Med.,2015,7(287): 270-287.

[10] Lee R J, Fang Q, Davol P A,etal.. Antibody targeting of stem cells to infarcted myocardium[J]. Stem Cells,2007,25(3):712-717.

[11] Zhao T C, Tseng A, Yano N,etal.. Targeting human CD34+ hematopoietic stem cells with anti-CD45 x anti-myosin light-chain bispecific antibody preserves cardiac function in myocardial infarction[J]. J. Appl. Physiol.,2008,104(6):1793-1800.

[12] Xie Z, Guo N, Yu M,etal.. A new format of bispecific antibody: highly efficient heterodimerization, expression and tumor cell lysis[J]. J. Immunol. Methods,2005,296(1-2):95-101.

[13] Li B, Meng Y, Zheng L,etal.. Bispecific antibody to ErbB2 overcomes trastuzumab resistance through comprehensive blockade of ErbB2 heterodimerization[J]. Can. Res.,2013,73(21):6471-6483.

[14] Kou G, Shi J, Chen L,etal.. A bispecific antibody effectively inhibits tumor growth and metastasis by simultaneous blocking vascular endothelial growth factor A and osteopontin[J]. Can. Lett., 2010,299(2):130-136.

[15] Zhang D, Li B, Shi J,etal.. Suppression of tumor growth and metastasis by simultaneously blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-A and VEGF-C with a receptor-immunoglobulin fusion protein[J]. Can. Res.,2010,70(6):2495-2503.

[16] Zhao L, Yang Y, Zhou P,etal.. Targeting CD133high colorectal cancer cells in vitro and in vivo with an asymmetric bispecific antibody[J]. J. Immunother., 2015,38(6):217-228.

Application of Bispecific Antibody Drugs

LI Geng, LIU Xiao-zhi, WANG Zhi-ming, GAO Jian*

StateKeyLaboratoryofAntibodyResearch&Development;NewDrugResearchandDevelopmentCompanyLTD.,NorthChinaPharmaceuticalCorporation,Shijiazhuang050015,China

Rapid development of gene engineering has led to the success of the new type of bispecific antibody drugs. At present, the application of dual bispecific antibody drugs was in tumor immunotherapy, autoimmune diseases, infectious diseases, tissue regeneration and clinical diagnosis. In this paper, the brief development history was introduced, and applications of bispecific antibodies in immunological therapy, tissue regeneration and clinical diagnosis were reviewed. At last, development prospect was forecasted. The paper was expected to provided reference for the research and development of new bispecific antibody drugs.

BiTE (bispecific T cell engager); bispecific antibodies; immunotherapy; regenerative medicine

2015-09-08; 接受日期：2015-09-25

国家科技重大专项项目( 2012ZX09101313) ；河北省重大科技成果转化专项(13042404Z)资助。

李耿，工程师，主要从事蛋白药物研发。E-mail: 13073182298@163.com。*通信作者：高健，高级工程师，主要从事蛋白药物研发。E-mail: gaojian3993@aliyun.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.03