摘要：以酿酒酵母中已经报道的5个典型PITP序列为基础，对炭疽菌属蛋白质数据库进行Blastp比对以及关键词搜索，并通过SMART保守结构域分析，明确该菌含有4个典型的PITP；同时，通过对上述氨基酸序列进行疏水性、细胞信号肽、跨膜区结构域、亚细胞定位以及二级结构等生物信息学分析，并与其他物种中15个同源序列进行遗传关系比较分析，以期为深入开展希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）PITP的功能研究打下理论基础，同时，也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。

关键词：希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）；磷脂酰肌醇转移蛋白质；生物信息学分析；遗传关系；炭疽菌属

中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）03-0713-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.055

Bioinformatic Analysis on PITP in Colletotrichum higginsianum Sacc.

HAN Chang-zhi

（College of Forestry/Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

Abstract： Based on the five typical PITP sequences reported in Saccharomyces cerevisiae Sacc.， to search PITP related protein sequence from the protein databases of Colletotrichum spp. with the Blastp as well as the use of keywords， four typical PITP were identified by conserved domain analysis in the SMART online. Meanwhile， bioinformatic analysis were made including the hydrophobic， signal peptide， trans-membrane domain structure， sub-cellular location and the secondary structure in four PITP proteins. In addition， the analysis of genetic relationships through comparative four PITPs in C. higginsanum with other species of 15 homologous sequences can provide strong theoretical foundation for the function of PITP， and an important theoretical guidance to clarify the other pathogens in Colletotrichum spp.

Key words： Colletotrichum higginsanum Sacc.； PITP； bioinformatics analysis； genetic relationship； Colletotrichum spp.

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc.）属于炭疽菌属真菌，其可以侵染如菜心、小油菜、结球甘蓝、羽衣甘蓝、大白菜、萝卜等多种十字花科蔬菜作物而引起炭疽病，是一类重要的世界性植物真菌病害，现主要分布于美国、中国、日本以及印度等国[1-3]。在我国，由该病菌侵染菜心引起的炭疽病是菜心上最常见和发生最严重的病害之一[4]。该病害对广东省菜心种植地区具有重要的影响，不仅降低了菜心的产量，对菜心的品质也产生了较大影响[5，6]。国内外对该病菌的研究主要集中在生物学特性、生防菌筛选以及遗传转化等方面[7，8]，同时，随着该病菌基因组序列的释放[9]，林春花等[10]对其开展了MAPK途径相关基因的找寻及信号通路简图的绘制工作。

磷脂酰肌醇转移蛋白质（Phosphatidylinositol transfer protein，PITP）是一类广泛存在于真核生物细胞中具有一个疏水性强的水溶性蛋白质载体，其功能在于把一分子的脂类物质包裹在疏水腔内，使包裹的脂类物质远离细胞质内水溶性的环境，从而实现脂类物质在不同膜间定向转运[11]。该蛋白质通过参与调节脂类代谢途径和胞内进程，从而在多个复杂的生理发育过程中发挥重要作用[12]。目前，认为在肌醇磷脂代谢途径中发挥重要作用的有PITP-PLC（磷脂酶C）途径、CDP（胞嘧啶核苷二磷酸）-胆碱生物合成途径[13，14]。学术界对于植物中所含有的PITP有较多报道，如大豆、日本百脉根、拟南芥以及棉花等，而对于真菌PITP的研究报道较为少见。

本研究以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288c）中已经报道的5个典型PITP氨基酸序列为基础，通过在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Blastp比对分析以及关键词搜索，获得与酿酒酵母PITP同源的C. higginsanum序列，并通过保守结构域分析、疏水性分析、二级结构预测等生物信息学分析，以期明确该菌中所存在的PITP数量、疏水性特点、结构特征以及细胞定位情况，同时，基于上述PITP氨基酸序列，在美国国家生物信息中心（NCBI）在线进行同源序列搜索，通过遗传关系分析，以期为进一步开展其他炭疽菌中PITP的研究提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

根据酿酒酵母中含有的5个PITP（Sec14、Pdr16、Pdr17、Sfh5和CSR1）氨基酸序列，利用炭疽菌属蛋白质数据库在线进行Blastp比对[15]，所有参数均选择默认值，获得C. higginsianum中所含有的典型PITP，同时，通过输入“Phosphatidylinositol-transfer-protein”、“PITP”关键词，在上述数据库中进行PITP检索；另外，利用NCBI明确该菌中PITP蛋白质登录号信息（表1）。

1.2 方法

1.2.1 保守结构域预测 利用SMART网站在线分析PITP所具有的保守结构域特征。

1.2.2 蛋白质疏水性预测 利用Protscale程序[16]对PITP进行疏水性测定。

1.2.3 蛋白质转运肽及信号肽预测 转运肽的预测利用TargetP 1.1 Server进行在线分析[17]，信号肽预测则是利用SignalP 3.0 Server[18]进行在线分析。

1.2.4 蛋白质二级结构及跨膜区结构预测 对蛋白质二级结构预测采用PHD[19]进行在线分析。同时，对其PITP的跨膜区结构进行预测，利用TMHMM Server v. 2.0进行在线分析[18]。

1.2.5 亚细胞定位分析 对C. higginsianum中PITP进行亚细胞定位分析，利用ProtComp v.9.0进行在线分析[20]。

1.2.6 系统进化树构建 在NCBI中，以C. higginsianum中所含PITP氨基酸序列为基础，在线进行Blastp同源搜索，获得来自不同物种的同源蛋白质序列。对所获得的同源序列，利用Clustal X软件[21]进行多重比对分析，随后利用MEGA 5.2.2软件[22]构建系统进化树，采用邻近法构建系统发育树，各分支之间的距离计算采用p-distance模型，系统可信度检测采用自举法重复1 000次进行。

2 结果与分析

2.1 希金斯炭疽菌含有4个典型的PITP

对酿酒酵母中典型的5个PITP进行SMART分析，明确上述PITP均具有SEC14保守域结构，除Sfh5外，其他4个还具有一个存在于氨基酸序列N端，且尚未知功能的CRAL_TRIO_N保守域结构，同时，上述典型PITP所含氨基酸的大小范围为343～469 aa。

对炭疽菌属进行Blastp比对分析，除Sec14、CSR1具有同源的序列外，其他3个（Pdr16、Pdr17、Sfh5）在希金斯炭疽菌中均没有发现其同源序列。同时，结合关键词搜索，结果表明，C. higginsianum中存在4个与酵母中PITP同源性较高序列，其ID分别为CH063_00815.1、CH063_06673.1、CH063_01014.1、CH063_10638.1。根据SMART保守域分析，结果显示，上述4个蛋白质序列均含有典型PITP所具有的SEC14保守域（图1），按照氨基酸长度，重新对上述希金斯炭疽菌中的典型PITP进行命名，分别为ChPITP1、ChPITP2以及ChPITP3、ChPITP4（表1）。

2.2 蛋白质疏水性预测

疏水性分析结果显示，ChPITP1中位于291位的E，亲水性最强，数值达到-1.995，而位于179位的D，亲水性最弱，为0.921；ChPITP2中位于314、317位的Q、W，亲水性最强，而位于248位的T，亲水性最弱；ChPITP3中位于62位的T，亲水性最强，而位于294位的W，亲水性最弱；ChPITP4中位于66位的V，亲水性最强，而位于255位A，其亲水性最弱（表2，图2）。同时，发现ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4这4个典型PITP尽管在亲水性最强氨基酸残基位置和数值、疏水性最强氨基酸残基位置和数值、疏水性氨基酸残基数值总和以及亲水性氨基酸残基数值总和等方面的结果不尽相同，但均属于亲水性蛋白质，这与通过理化性质分析中的GRAVY计算所得结果一致。

2.3 转运肽及信号肽特征

通过分析，ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4具有分泌途径信号肽的可能性最大，其预测值分别为0.948、0.961、0.854、0.924（表3）。经过SingnalP 3.0 Server在线分析，上述4个PITP均不含有明显的信号肽序列。

2.4 二级结构及跨膜结构域预测

二级结构预测结果显示，4个PITP均含有α螺旋、β折叠、无规卷曲等二级结构，其中，ChPITP1、ChPITP3、ChPITP4所含α螺旋比例较高，分别为49%、51%、46%，而在ChPITP2中，其所含无规卷曲结构所占比例较高，为44%；对于β折叠结构，ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4所含比例均较低（图3）。

通过TMHMM Server v. 2.0在线分析，上述4个PITP均不含有典型的跨膜结构域，然而，通过二级结构预测发现ChPITP4在281到311位氨基酸之间存在一个跨膜结构域，两者预测不同，有待于今后通过试验进一步验证。

2.5 亚细胞定位分析

通过ProtComp v. 9.0在线分析，结果表明，4个典型的PITP亚细胞定位情况不尽相同，其中，ChPITP1、ChPITP2定位于高尔基体中，而ChPITP3定位于线粒体上，ChPITP4定位于细胞质中（表4）。

2.6 遗传关系

在NCBI中，通过对C. higginsianum 4个典型PITP序列进行Blastp搜索，分别获得ChPITP1、ChPITP2、ChPITP3、ChPITP4的同源序列，选择同源性较高的15条序列进行聚类分析，结果显示，上述4个PITP与其各自同源序列分别聚在一起，而彼此之间并未聚在一起；就C. higginsianum中每一个PITP与其他物种同源序列之间的亲缘关系而言，ChPITP1与禾谷炭疽菌中的EFQ27511.1、西瓜炭疽病菌中的ENH76666.1之间亲缘关系较近；ChPITP2与大丽轮枝菌中的EGY17177.1、黑白轮枝菌中的XP003005673.1亲缘关系较近；ChPITP3与C. graminicola中的EFQ29482.1之间的亲缘关系较近；ChPITP4与C. graminicola中的EFQ30498.1之间的亲缘关系较近（图4），这与前期关于禾谷炭疽菌PITP的亲缘关系研究所得结果一致[23]。

3 小结与讨论

C. higginsanum可侵染菜心、白菜等众多十字花科蔬菜引起炭疽病，不仅影响蔬菜的产量，也对其品质造成重要影响。深入开展该病菌的致病因子研究，有助于进一步开发以致病因子为作用靶标的防治药剂。2012年，随着该菌全基因组序列的释放[9]，为学术界对其开展致病因子研究提供了便利条件。

目前，已经明确PITP参与真核生物体内众多生理功能以及信号转导过程，然而，对于真菌中PITP的报道尚不多见。本研究基于酿酒酵母中已经报道的5个典型PITP序列，在炭疽菌属蛋白质数据库中，利用Blastp比对以及关键词搜索，同时，基于SMART保守域分析，共获得C. higginsanum 4个典型的PITP。利用生物信息学分析，初步明确了上述4个典型PITP在细胞信号肽、疏水性、亚细胞定位、跨膜结构域以及二级结构等方面具有的特征，为深入解析C. higginsanum PITP的功能研究打下坚实基础。与此相似，通过上述方法，也获得了C. graminicola中含有3个PITP，并明确上述PITP具有的相关特征。在炭疽菌属病菌中上述2种全基因组测序已经完成，而大多数危害农、林业生产的炭疽菌的全基因组测序尚未完成，因此，本研究基于C. higginsanum中典型PITP，通过遗传关系比较分析，可为进一步开展其他炭疽菌属真菌中PITP研究提供重要的理论指导。

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