谢美华等

摘要：对红豆杉（Taxus yunnanensis Cheng et Lu）茎灰斑病进行病原鉴定，并研究其生物学特性和杀菌剂对其抑制作用。结果表明，该病原菌为拟茎点霉属真菌；该病原菌最适宜生长的碳源为甘油，氮源为硝酸铵。菌丝适宜生长的温度范围较窄，25～28 ℃ 菌丝生长良好，分生孢子在32 ℃时萌发率最高；菌丝适宜生长的pH范围均较广，分生孢子萌发率较高，菌丝适宜生长的pH为6.0～7.0，弱酸性更利于孢子萌发；光周期对菌落生长和分子孢子萌发的影响都不大。供试的杀菌剂中以代森锰锌的抑菌效果最好。

关键词：云南红豆杉（Taxus yunnanensis Cheng et Lu）；茎灰斑病；病原鉴定；生物学特性

中图分类号：S718.81 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）03-0608-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.025

Pathogen Identification and Biological Characterstics of the Stem Spot

of Taxus yunnanensis

XIE Mei-hua1，LI lin2，LI Xue-lin1，YANG Hai-yan1，CHEN Hua-hong1，WANG Zhen-ji1，FAN Shu-guo1

（1. Department of Chemistry and Life Science， Chuxiong Normal University， Chuxiong 675000， Yunnan， China；2. Information Center，Chuxiong Pharmaceutical College/Key University Applied Biology Laboratory of Yunnan，Chuxiong 675000， Yunnan ， China）

Abstract： Pathogen of stem spot of Taxus yunnanensis Cheng et Lu was identified. Its biological characteristics and inhibition of germicides was studied. The results showed that the pathogen was Phomopsis sp. The best carbon and nitrogen source for hongdoushan 1 mycelial growth was glycerin and ammonium nitrate， respectively. The optimal temperature for mycelial growth and spore germination were 28 ℃ and 32 ℃， respectively. Light and dark alternative had little influence on mycelial growth and spore germination. In laboratory test， mancozeb was the best getrmicides on the tested.

Key words： Taxus yunnanensis Cheng et Lu； stem spot； pathogen identification； biological characterstics

云南红豆杉（Taxus yunnanensis Cheng et Lu）又名紫杉、赤柏松，属红豆杉科乔木，产于云南西北部及西部、四川西南部与西藏东部[1]。主要生长在山坡、针阔混交林中。云南红豆杉的茎皮中富含具有抗癌活性成分的紫杉醇，由此使得红豆杉身价急剧上升。自然环境中的红豆杉资源非常稀缺，所以目前红豆杉已被大面积的人工栽培。围绕云南红豆杉的研究主要集中在浸种育苗、扦插栽培、内生真菌研究等方面，而对于云南红豆杉大面积栽培引起病害大量滋生及病害如何防治的方面[2-7]鲜见报道。本研究选取红豆杉茎皮灰斑病的病斑，进行该病害病原的分离鉴定和生物学特性研究，以期为云南红豆杉病害控制和防治提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 病原菌分离

云南红豆杉茎灰斑病茎皮采自楚雄师范学院内，用组织分离法进行病原菌株分离，经柯赫氏法则鉴定其为云南红豆杉茎灰斑病的病原，菌株编号为hongdoushan01。

1.2 病原菌鉴定

1.2.1 形态学鉴定 经纯化分离得到病原菌，利用显微镜进行观察，对其进行形态鉴定。

1.2.2 病原茵rDNA-ITS序列扩增和分析 用CTAB法提取病原菌全基因组DNA，进行ITS-PCR扩增。引物序列为ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGAT

ATGC-3；ITS5：5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG

G-3。PCR反应体系总体积25 μL，反应各成分终浓度为：Taq酶0.02 U/μL；引物0.4 μmol/L；DNA 模板20 ng/μL；dNTPs 0.4 μmol/L；2×PCR反应缓冲液。PCR扩增程序为：预变性95 ℃，3 min；变性94 ℃，30 s，退火52 ℃，45 s， 复性72 ℃，45 s，30个循环；延伸72 ℃，10 min。扩增产物送北京百泰克生物技术有限公司测序，所得序列在NCBI上比对，下载与其相似性较高的序列及其近似属的序列，用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1软件采用NJ法进行系统分析，构建系统进化树。

1.3 生物学特性研究[8，9]

1.3.1 不同碳源和氮源对菌落生长的影响 以察氏培养基为基础培养基，分别以葡萄糖、甘油、D-果糖、D-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉等量取代其碳源；分别以硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸、L-苯丙氨酸、牛肉膏、蛋白胨取代氮源。每种培养基中分别接种直径为5 mm的菌块，25 ℃恒温暗室培养，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。每个处理设3个重复。

1.3.2 不同温度对菌落和分子孢子萌发的影响 取直径为5 mm的菌块接种于察氏培养基中央，分别在5、10、15、20、25、28、30、32、35、40、45 ℃暗室下恒温培养，5 d后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落培养，24 h后镜检孢子萌发率，每次检100个孢子。每个处理设3个重复。

1.3.3 不同pH对菌落和孢子萌发的影响 将高压灭菌后的察氏培养基pH分别调为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9，倒平板，取直径5 mm的菌块接种于察氏培养基中央，黑暗条件下25 ℃培养5 d后测量菌落直径。用0.2 mol/L磷酸氢二钠和0.2 mol/L柠檬酸缓冲液将分生孢子悬浮液pH调配为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、10.9，置于25 ℃恒温箱暗室培养，24 h后镜检萌发率，每次检100个孢子。每个处理设3个重复。

1.3.4 不同光照处理 取直径为5 mm的菌块接种于察氏培养基中央，分别置于24 h光照、12 h/12 h光暗交替，25 ℃培养5 d后测量菌落直径。用无菌水制备菌悬液，滴于载玻片上，培养条件同菌落培养，24 h后镜检孢子萌发率，每次镜检100个孢子。每个处理设3个重复。

1.4 不同杀菌剂对菌落生长的影响

将代森锰锌、百菌清、敌克松、恶霜锰锌和扑海因用无菌水按其常用倍数稀释，每10 mL培养基中加入1 mL药液制成含药液的平板，对照组加入等量无菌水。取5 mm菌块置于察氏培养基平板中央，25 ℃暗室培养5 d后测量菌落直径。每个处理设3个重复。

2 结果与分析

2.1 云南红豆杉病原菌的鉴定

2.1.1 形态学鉴定 该病主要发生在茎部，发病初期茎皮部出现黑色病斑或病块，病情严重时，病块可延伸至整株植物的茎。在PDA培养基上，28 ℃培养第3天菌落直径2 cm ，不规则，不透明；菌丝深褐色、絮状、短，外周为白色絮状极短菌丝，背面深褐色，外周为白色；菌丝生长较慢，28 ℃培养第7天菌落直径为5 cm；培养第15天长满全皿，培养基正面不均匀分布黑色小圆点，背面出现少量小黑点；培养第20天，正面有黏稠的分泌物出现（图1）。分生孢子座为真子座，埋生或半埋生，后暴露，黑色，球形或不规则形，分散或合生，含单腔、多腔，腔壁厚，周边颜色深，无孔口，孢子团冲破上壁而开裂；分生孢子梗缺；产孢细胞无色至淡褐色，安瓿瓶状，内壁芽生瓶体式产孢，产孢口宽，围领及平周加厚不明显；分生孢子无色，单胞，椭圆形，光滑，大小2.5～5.3 μm×3.2～4.9 μm（平均3.6 μm×4.2 μm）（图2与图3）。

2.1.2 病原菌rDNA-ITS序列分析 将云南红豆杉01菌株的5.8S rDNA-ITS序列在NCBI里进行序列比对，结果显示hongdoushan01与Diaporthe eres、Phomopsis amygdali、Phomopsis sp.、Phomopsis vaccinii、Phomopsis magnoliae和Phomopsis juglandina同源性最高，下载它们的序列，以Phoma sp.和Phoma schachtii为外群，用BioEdit、Clustal x和MEGA 4.1软件采用NJ法进行系统分析，构建系统进化树。结果显示与其遗传距离较近的有6个种，属内节点支持率为0.99，结合其形态特征的观察研究，供试菌株hongdoushan01为拟茎点霉属（Phomopsis sp.）。

2.2 不同氮源和碳源对hongdoushan01菌落生长的影响

试验结果表明，该菌对供试的7种氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培养基上生长速度有明显差异。最适该菌生长的氮源是硝酸铵，其在1%差异水平与甘氨酸、硝酸钠作氮源达到极显著差异，与硫酸铵、牛肉膏和蛋白胨作氮源在5%差异水平达到显著差异。最适该菌生长的的碳源是甘油，在5%差异水平与葡萄糖、D-果糖、可溶性淀粉和蔗糖达到显著差异，在1%差异水平与D-半乳糖与乳糖达到极显著差异（见表1）。

2.3 不同光照对hongdoushan01菌株生长的影响

通过24 h光照，12 h/12 h光/暗交替、无光照培养，结果表明（表2），有无光照对菌落的生长和分生孢子萌发的影响差异不显著。

2.4 不同温度对hongdoushan01菌落生长和孢子萌发的影响

试验结果表明，该病原菌在15～30 ℃范围内均能生长，最适的生长温度是28 ℃，与20、25和30 ℃在5%水平存在显著差异，与其他处理在1%显著水平达到极显著差异；该病原菌在5、10、32、35、40、45 ℃条件下停止生长。该病原菌孢子在5～40 ℃范围内均能萌发，最适萌发温度为32 ℃，高于40 ℃孢子无法萌发，与20、25、28、35 ℃在5%水平存在显著差异，与其他处理在1%水平显著水平达到极显著差异（表3）。

2.5 不同pH对hongdoushan01菌落生长和孢子萌发的影响

试验结果表明，菌丝和分生孢子萌发适应的pH值范围较广，在pH 2.5～10.9之间均能生长和萌发。该菌菌丝在酸性条件下生长较好，在碱性条件下生长缓慢；该菌生长最适宜的pH为7.0，与pH为3.0～6.0处理差异不明显，与pH为8.0～10.9处理在5%水平存在显著差异。当pH 6.0时孢子萌发率最高，pH 6.0时的孢子萌发率与pH 4.0、5.0、7.0和9.0时孢子萌发率在5%水平存在显著差异，与其它处理达到极显著差异（表4）。

2.6 不同杀菌剂对菌落生长的影响

试验结果表明，与对照相比，5种广谱杀菌剂对该菌的生长均有抑制作用（图5）。代森锰锌对该菌的抑制效果最好，随后依次是百菌清、扑海因、恶霜锰锌，效果最差的是敌克松。代森锰锌的抑菌效果在5%差异水平与扑海因、百菌清达到差异显著，与敌克松和恶霜锰锌在1%水平达到极显著差异。

3 小结与讨论

3.1 病原菌的分离鉴定

自然分布的云南红豆杉原先主要生长在深山中，由于具有抗癌活性的紫杉醇的发现，使云南红豆杉的药用价值得以认识，目前已有很多地方进行大面积栽培。大面积栽培使病害发生严重，而目前还未见对云南红豆杉茎灰斑病病原菌的报道。本研究通过对云南红豆杉茎灰斑病病原菌进行分离纯化，利用形态学特征观察并结合分子生物学手段进行分析鉴定[10，11]，结果表明，两者的鉴定结果相互吻合一致，初步推测病原菌为拟茎点霉属真菌。

3.2 病原菌生物学特性研究

本研究结果表明，该菌对供试的7种氮源和碳源均能利用，菌落在不同氮源和碳源培养基上生长速度有明显差异，最适该菌生长的的氮源是硝酸铵，最适该菌生长的碳源是甘油。该病原菌在15～30 ℃范围内均能生长，最适的生长温度是28 ℃，在5、10和32℃及以上温度条件下停止生长；该病原菌孢子在5～40 ℃范围内均能萌发，高于40 ℃孢子无法萌发； 有无光照对菌落生长和孢子萌发无显著影响；菌丝和分生孢子萌发适应的pH范围较广，偏酸的条件下对菌丝生长和孢子萌发较好，孢子萌发最适宜的pH为6.0。

3.3 广谱杀菌剂对该菌生长的影响

在本研究中5种广谱杀菌剂对该菌落的生长均有抑制作用。代森锰锌对该菌的抑制效果最好，随后依次是百菌清、扑海因、恶霜锰锌，效果最差的是敌克松。该菌的生物学特性研究都是在实验室中进行，相对于大田种植时复杂的生长环境，实验室的环境相对单一。因此，要确定该病害的生物学特性，哪一种杀菌剂对该菌的抑制作用最好，还有待进一步的大田试验研究。

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