王超群 陈洪高 张运鹏

摘要： 利用羧甲基纤维素钠培养基，从腐烂苎麻秆堆中分离到1株高效纤维降解细菌，形态学观察结合16S rRNA基因分子鉴定。结果表明，该菌属于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），发酵进行产酶的最适温度和pH分别为42 ℃和7.0，在该条件下，于100 mL发酵体系中发酵降解苎麻纤维，发酵96 h 后纤维素酶活力达到最高值24.3 U/mL，发酵8 d后其纤维降解率为45.1%。

关键词：苎麻纤维；纤维素酶；16S rRNA；Bacillus cereus

中图分类号：S563.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）03-0565-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.03.014

Isolation and Identification of Highly Efficient Degrading Strain of Cellulose in Ramie

WANG Chao-qun，CHEN Hong-gao，ZHANG Yun-peng

（School of Environmental Engineering， Wuhan Textile University，Wuhan 430020， China）

Abstract： A cellulose degrading strain J04 was isolated from rotting ramie straws by using sodium carboxymethylcellulose as a sole carbon source and identified as Bacillus cereus by morphological observation combined with 16S rRNA gene sequencing. The results showed that the optimal temperature and pH for cellulase producing of J04 was 42 ℃ and 7.0， respectively. The highest cellulase activity reached 24.3 U/mL when J04 was grown in a ramie fiber medium for 4 days. About 45.1% was degraded after 8-days incubation under the optimal conditions.

Key words： ramie fiber； cellulase； 16S rRNA； Bacillus cereus

随着石油资源的日益枯竭、全球能量的需求持续增长和城市空气污染的日益严峻，可再生燃料和燃烧后释放温室气体较少的生物燃料正在成为化石燃料的理想替代品。纤维素是地球上最丰富的可再生有机物资源和重要的生物能源原料。芒草、麻类作物、作物秸秆和木材废料等都含有丰富的纤维素成分[1]，作为第二代生物能源技术，欧美各国正在将纤维资源利用重点研发[2]。

纤维素酶（CMC）是实现纤维素降解的关键酶，只有纤维水解成了可溶性糖，才能被微生物发酵转化成生物能源[3]。由于真菌纤维素酶不如细菌纤维素酶那么复杂，容易分离纯化，目前主要用真菌来生产纤维素酶，如木霉、曲霉、青霉、根霉和漆斑霉等[4]。然而，细菌纤维素酶也具有其独特的优势，如：细菌生长较快，比真菌更容易重组出较高产率的纤维素酶；细菌纤维素酶虽然复杂但同时也赋予其更多功能，在降解纤维时能够很好地协作；细菌纤维素酶比真菌纤维素酶更能适应酸、碱、热、盐等极端环境，具有更广泛的工业应用前景。因此，细菌纤维素酶最近正受到越来越广泛的关注[5]。研究较多的产纤维素酶细菌主要有Bacillus subtilis、Clostridium

acetobutylicum、Clostridium thremocellum和Pseud-ononas cellulose，关于Bacillus cereus降解纤维的报道并不多见。

本研究从腐烂苎麻秆堆中筛选出1株高效降解苎麻纤维的微生物，优化其发酵条件，研究其产酶特征，鉴定其种属，为苎麻生物量的高效利用探索途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 微生物 从咸宁湖北新农生态麻业有限公司园区一个长期露天堆置的苎麻秆堆中收集正在腐烂麻秆残渣约200 g，立即带回实验室用500 mL无菌水浸洗，然后用双层纱布过滤去除残渣，滤液4 000 r/min离心10 min，上清液作为菌源备用。

1.1.2 培养基 富集培养基：CMC-Na 15 g/L，K2HPO4 1 g/L， Na2CO3 5 g/L， MgSO4·7H2O 0.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.15 g/L，酵母浸出粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，pH自然，121 ℃灭菌30 min。

CMC-Na分离培养基：羧甲基纤维素钠（CMC-Na）15g/L，酵母膏0.2 g/L，KH2PO4 1g/L， NH4NO3 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，琼脂20 g/L，pH自然，121 ℃灭菌30 min。

CMC-Na筛选培养基：CMC-Na 15 g/L，KH2PO4 1 g/L， NH4NO3 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，琼脂20 g/L，pH自然，121 ℃灭菌30 min。培养4 d后用刚果红进行染色鉴定。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。

CMC-Na发酵培养基：酵母膏0.2 g/L，蛋白胨3 g/L，CMC-Na 10 g/L，（NH4）2SO4 2 g/L， KH2PO4 4 g/L， MgSO4·7H2O 0.3g/L， CaCl2·2H2O 0.3 g/L， pH自然，121 ℃灭菌30 min。

苎麻纤维发酵培养基：苎麻纤维20 g/L，酵母膏 4 g/L，NH4NO3 4 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L， KH2PO4 4 g/L，pH自然，121 ℃灭菌30 min。（将除苎麻纤维之外的部分配成溶液储存，灭菌的苎麻纤维临用时加入。）

1.2 方法

1.2.1 富集培养 取20 mL菌原液接种到80 mL富集培养基中，42 ℃恒温培养4 d。

1.2.2 初筛 取富集培养液稀释成10-3、10-4、10-5，涂布于CMC-Na固体培养基，每个稀释梯度涂布3个平板，42 ℃恒温培养至长出菌落，然后在相同的培养基上通过反复划线分离单菌落。

水解圈试验：挑取分离得到的单菌落点种于CMC-Na筛选培养基上，42 ℃恒温培养3 d，用1 mg/mL的刚果红溶液染色平板30 min，再用蒸馏水清洗，最后用1 mol/L NaCl溶液脱色30 min，以透明圈的直径和菌落直径的比值大小作为筛选标准，挑选比值较大的菌再进行划线分离，镜检确认为纯的单菌落后，接种于牛肉膏蛋白胨培养基上保存。

1.2.3 复筛 将筛选得到的菌种接种到CMC-Na发酵培养基上，42 ℃、150 r/min振荡培养4 d，5 000 r/min离心15 min，上清液作为粗酶液测定CMC酶活。酶活测定采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法[6]，取粗酶液0.5mL，加入1% CMC-Na溶液0.5mL，45 ℃反应30 min，迅速加入1.5 mL DNS，在100 ℃沸水浴中反应5 min，稀释至10 mL，以在100 ℃沸水浴中保温20 min失活的粗酶液作为空白，用葡萄糖制作标准曲线，在酶标仪上540 nm处测定吸光度，计算纤维素酶活。酶活单位定义为：每分钟水解纤维素产生1 μmol葡萄糖所需要的酶量为1个酶活单位U。

1.2.4 发酵温度与pH条件优化 在试验中，温度设置32、37、42 和47 ℃共4个梯度，pH设置6、7、8、9共4个梯度，每个温度-pH组合3次重复。发酵体系为：在250 mL三角瓶中，预加100 mL CMC-Na发酵培养基，按10%（V/V）接种量添加菌种。将三角瓶置于不同的温度和pH条件下，150 r/min振荡培养4 d，5 000 r/min离心15 min，上清液作为粗酶液测定CMC酶活，取平均值用于比较分析。

1.2.5 菌株生长曲线测定 发酵体系同“1.2.4”，调节初始pH 7.0， 42 ℃，100 r/min振荡培养，3次重复。在分光光度计上，用初始发酵液作为空白调零，在波长600 nm下每隔18 h取培养液测定一次吸光度（OD600 nm），连续测定126 h。

1.2.6 纤维发酵试验 将初筛接菌种到1 L CMC-Na发酵培养基上，42 ℃、150 r/min振荡培养4 d，培养液作为菌酶混合液备用。在250mL三角瓶中预加100 mL苎麻纤维发酵培养基（含2 g灭菌苎麻纤维），接种10 mL菌酶混合液，于 42 ℃、100 r/min振荡培养。共接种30瓶，从接种开始，每隔2 d取出3瓶，用200目筛过滤，滤渣先用稀盐酸和硝酸混合液冲洗，再用热水（80～100 ℃）冲洗干净，105 ℃烘干，称纤维残余重量，按如下公式计算失重率，试验持续9 d。另外3瓶用于观测发酵过程中纤维素酶活力动态变化，每24 h检测 1次，直至试验结束。失重率及纤维素酶活力取平均值用于分析。

失重率=[G1-G2]÷G1×100%

式中，G1为纤维的初始重量；G2为微生物降解后剩余纤维重量。

1.2.7 菌株分子鉴定 用TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒提取细菌基因组总DNA，细菌16S rRNA 基因通用引物进行PCR扩增，通过16S rRNA 基因测序鉴定菌株。PCR引物序列为：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R1492：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增条件为：95 ℃ 5 min变性；94 ℃ 45 s，54 ℃退化45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物送至三博远志公司纯化后测序。对测序得到的16S rDNA基因序列进行BLAST分析，在GenBank中进行同源性比较，利用MEGA 5.05软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离

经过富集培养、划线分离和水解圈试验，筛选出1株高产纤维素酶的细菌，编号为J04。该菌在CMC-Na筛选培养基上42 ℃恒温培养3 d，菌落直径与水解圈直径之比约为1∶4。在CMC-Na发酵培养基上42 ℃培养4 d，纤维素酶活为23.6 U/mL。

2.2 菌株的形态特征

菌株J04呈革兰氏阳性，直杆菌（图1a），菌落成短或长链排列。芽孢圆形，孢囊无明显膨大。菌落扁平，圆形或近似圆形，灰白色，不透明，边缘不规则，略有光泽，中部略凸起，表面较粗糙，似融蜡状（图1b）。

2.3 菌株发酵的最适温度与初始pH

由图2可知，当温度处于37～47 ℃范围时，发酵体系中能检测到较高的纤维素酶活力，其中以42 ℃左右为最佳。在37～47 ℃的范围内，菌株在中性初始pH时产酶能力最强，但在pH 6～8能保持较高的产酶能力（大于16 U/mL），说明该菌株有较强的环境适应能力。同时，试验结果还表明，当温度低于37 ℃，或pH大于9时，菌株的生长和产酶将明显受到限制。

2.4 菌株的生长曲线

菌株J04在CMC-Na发酵培养基中42 ℃振荡培养，经过约18 h的缓慢生长期后，开始进入对数期生长（图3）。整个对数生长期经历了大约54 h，然后进入稳定期。累计培养108 h后，菌群密度开始呈现出下降趋势。

2.5 CMC酶活与纤维降解效果

将J04接种到苎麻纤维发酵培养基中，42 ℃培养至2 d结束时检测到纤维素酶活开始上升，在持续急剧上升3 d（第五天）后接近最大值（24.3 U/mL），（图4）。纤维的降解速率与发酵体系中纤维素酶的变化密切相关，发酵2 d时检测到有大约2.6%的纤维被降解，此后随着纤维素酶活的持续上升，纤维降解速率明显加快，在第六天结束时累计降解18.8%，第八天结束时累计降解45.1%，表明菌株J04有较强的降解苎麻纤维的能力。

2.6 菌株的16S rRNA基因鉴定

测定序列长度为1 437 bp，将该序列在GenBank中通过Blast进行序列同源性比较，发现该序列与Bacillus cereus strain D26亲缘关系最近（表1），同源性达到99%。选取以16S rRNA基因序列同源性为基础排序的亲缘关系前10位的菌株，同J04一起构建系统发育进化树（图6），结果J04处于一个单独分支上，说明菌株J04具有相对独立的进化地位。结合形态学特征和16S rRNA基因序列分析结果，可将菌株J04初步鉴定为Bacillus cereus。

3 讨论

关于蜡样芽孢杆菌产纤维素酶的文献并不多见，Thayer[7]及Ramin等[8]从白蚁腔肠、Lu等[9]从植物堆肥中都曾分离到能产纤维素酶的蜡样芽孢杆菌，但这些研究多局限于菌种鉴定阶段，未见相关后续报道。Prakash等[10]从沼泽泥土中、钱林等[11]从湖底沉积物中筛选到了蜡样芽孢杆菌，这些菌株虽然纤维素酶活力都较高，但实际降解滤纸纤维时表现并不理想。燕红等[12]从土壤中分离到的蜡样芽孢杆菌对稻草表现出了较好的降解能力。本试验从苎麻腐烂堆中再次分离出了蜡样芽孢杆菌，该菌生产纤维素酶的能力超过了前述的报道，在实际降解苎麻纤维方面的表现也比较突出，兼具降解结晶和非结晶纤维的能力，加之其独特的进化地位，表明该菌株可能由于长期处于苎麻秆腐烂堆中而获得了驯化并累积了突变。

苎麻是中国传统的多年生宿根纤维作物，对土壤和肥水要求低，适宜种植区域广泛，每公顷年产干物质22.5 t以上，因而资源比较优势十分突出。然而，目前苎麻总生物量中只有10%左右（韧皮纤维）被有效利用，70%左右（麻秆和麻叶）被废弃。麻秆和麻叶均含有丰富的纤维成分，因此，苎麻纤维降解高效菌的开发，对于促进苎麻纤维加工废弃生物质的资源化利用具有十分重要的意义。

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