王宝琴，任丽丽

（1.滨州学院 山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东滨州256600；2.滨州学院滨州市食品安全重点实验室，山东滨州256600）

角鲨烯（Squalene），又称三十碳六烯，或 2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。角鲨烯是由6个异戊二烯单位构成的不饱和脂肪烯烃，分子式为C30H50，含6个全反式双键的开链三萜物质。角鲨烯成品为微黄色至无色透明油状液体，略带特有的芳香味。因其具有极强的抗氧化、抗菌和抗紫外线辐射等活性而备受关注。

1 角鲨烯生物活性及其应用

1906年，Mitsumaru Tsujirnoto首先发现角鲨烯大量存在于深海鲨鱼的肝脏中[1]。1929年，Heilbron等初步揭示了角鲨烯的结构组成[2]。1953年，Langdon RG等发现角鲨烯存在于人体的皮脂中，此发现将角鲨烯和化妆品紧密联系起来[3]。小鼠静脉注射和口服角鲨烯实验表明其LD50分别为1 800 mg/kg和5 000 mg/kg[4]，根据外来化合物毒性分级标准，属实际无毒物质。

角鲨烯是所有细胞中甾醇的前体，是一种非常重要的功能油脂[5]，具有极强的抗氧化[6]、清除自由基作用[7]。角鲨烯具有类似红细胞的摄氧功能，可生成活化的氧化角鲨烯，由血液循环输送到机体组织后释放出氧，从而增强机体组织对氧的利用能力。同时，角鲨烯具有渗透、扩散和杀菌作用，人体皮肤分泌物中的角鲨烯和甾醇可维护皮肤柔软滑润。此外，研究表明角鲨烯对高血压、糖尿病、冠心病及癌症具有治疗作用，对乙型肝炎阴转率优于通用的保肝药物[7-8]。尤其是角鲨烯具有抵御紫外线伤害的功能，而常被大量用于护肤品中[9]。角鲨烯乳液被大量应用于疫苗和药物载体[10]。最新研究表明，角鲨烯与抗肿瘤药物阿霉素（squalenoyl doxorubicin，SQ-Dox）的纳米装配技术可以提高肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，并且可降低心脏毒性，在抗肿瘤治疗中有显著的改善效果[11]。角鲨烯有很低的凝固点（-72℃）和较高的沸点（350℃左右），有很好的抗热和抗摩擦性，也被用来制作高级润滑油和精密科学仪器的润滑剂[12]。

2 角鲨烯来源及自然分布

目前，角鲨烯的主要来源和最重要的自然分布仍然是深海鲨鱼的肝油，因为鲨鱼肝的出油率高且角鲨烯的含量丰富，可达50%以上。但是，并非所有深海鲨鱼的肝油中都存在角鲨烯，不同品种鲨鱼肝油的比重具有较大差异，15℃条件下比重大于0.9的鲨鱼肝油中一般不含角鲨烯[1]。人类皮肤脂肪中大约有12%的角鲨烯，这也是皮肤能够抵御紫外线侵袭的重要原因[3]。

大量研究证明，自然界中还有部分角鲨烯存在于橄榄油、棕榈油、麦胚油和酵母中。能形成角鲨烯规模生产的原料为橄榄油和棕榈油，其中角鲨烯含量均达到1.16%以上，而且可利用油脂的副产物如脱臭熘出物和渣油为原料获得纯度较高的角鲨烯，并大幅降低制造成本。新发现的角鲨烯来源以植物为主，罗汉果种仁出油率51.5%，其油脂和渣油中角鲨烯含量分别达4.4%和0.34%，其他如省沽油、糯米香茶、梅树、榄仁树、尾巨桉等均可成为制取角鲨烯的原料而成为新热点。近年发现苋属植物中也含一定量的角鲨烯，不仅存在于种子油中，其他组织中也有分布[13]。2011年，古巴学者报道了从用于治疗多种疾病的热淤泥中分离鉴定了50多种活性物质，其中就有角鲨烯[14]。

另外，可从微生物如面包酵母和圆孢酵母油脂中分离纯化角鲨烯[15]。笔者从啤酒工业废弃酵母提取物中发现三萜烯占精制酵母油脂总量的37.74%，制备的角鲨烯含量达2.01g/100 g（以干酵母计）。利用废弃酵母获取角鲨烯，不仅提高了废弃酵母的附加值，且综合利用解决了废弃物的环保问题，实现循环经济[16]。对酵母进行基因改造后使其中合成角鲨烯相关的酶高效表达，以提高发酵过程中角鲨烯的产量将成为新的研究热点。

3 角鲨烯制备方法

3.1 动物来源的角鲨烯

传统制备角鲨烯的方法是通过蒸馏获得鲨鱼肝油浓缩液或对肝油进行皂化再进行减压蒸馏、脱酸，与钠盐减压蒸馏或将氧化或溴化法呢基（Farnesyl）用金属镁或金属钙缩合等方法，最后采用溶剂（乙醇）处理，经减压蒸馏，得到角鲨烯精制品[17]。

Owen等在实验室和中试规模上采用超临界CO2对鲨鱼肝油进行了连续提取。鲨鱼肝油含50%角鲨烯，是萃取回收的主要成分，另一种主要成分甘油三酯以抽余油的形式回收，而姥鲛烷，是萃取回收液流的第二主要成分。超临界CO2萃取的分离效果取决于温度、压力、油对CO2流速比率、物料装填高度和回流比率等。压力、温度、原料油中角鲨烯的浓度决定油在CO2中的负载量，油对CO2的比率决定角鲨烯在两个回收液流中和抽余油中的浓度。油的流速与角鲨烯流速之比，要求刚好达到使CO2饱和，这对CO2携带量和终产品的组成是非常重要的参数。在250 bar（25 MPa）和333 K（约60℃）的分离条件下，中试试验中应用回流，能将产品回收液流中的角鲨烯含量从92%（质量比）提高到 99%（质量比）[18]。

3.2 植物来源的角鲨烯

3.2.1 植物油副产物中提取

专利CN101597204A中以橄榄油为原料提取高纯度角鲨烯，采用二级分子蒸馏和硅胶柱色谱法形成的工艺路线，可将橄榄油中角鲨烯的含量从3.6%提高到98%左右，实现以橄榄油为原料大规模生产角鲨烯[19]。专利CN1849331A公开了自植物油副产品回收植物脂质组合物的方法。产生的植物脂质组合物包含角鲨烯、植物甾醇、混合生育酚和植物蜡，可用作润肤剂。其步骤包括：（1）在170℃～320℃的温度和13.33 Pa～4 665.5 Pa的压力下，蒸馏包含混合生育酚、脂肪酸、烃类、植物蜡、脂肪酸甾醇酯、甾醇、三萜醇、角鲨烯、甲基-甾醇和甘油单-、双-和三酸酯的植物油副产物，产生（i）含脂肪酸和低沸点烃类的蒸气产物及（ii）液体产物；（2）在 230℃～300℃和 0.066 65 Pa～133.3 Pa的压力下，蒸馏步骤（1）的液体产物，产生（i）含混合母育酚浓缩液、角鲨烯、植物甾醇和植物蜡的第二蒸气产物和（ii）第二液体产物；（3）使得自步骤（2）的经冷凝的蒸气产物与选自链烷醇或丙酮与水的混合物的萃取剂充分接触，随后使得到的混合物分离成两相，包括（i）含大部分萃取剂的第一相和（ii）含大部分步骤（2）的经冷凝的蒸气流出液的第二相；（4）收集在步骤（3）中形成的第二相；（5）冷却在步骤（3）中形成的第一相以形成沉淀，随后收集沉淀；（6）合并在步骤（4）中收集的第二相与在步骤（5）中收集的沉淀并且除去步骤（4）和（5）中收集的物料中的步骤（3）所使用的萃取剂；由此得到含10%～40%角鲨烯、2%～20%植物甾醇、1%～10%混合母育酚和40%～80%植物蜡的植物脂质组合物[20]。

Sugihara等研究了一种从油脂加工脱臭物或未氧化变质的脱臭物废皂化物中分离浓缩角鲨烯和植物甾醇的新方法。以超临界CO2提取法，在30℃、100 kg/cm2（9.8 MPa）、CO2流速7 mL/min的条件下，将角鲨烯浓缩到25%的含量，再利用硅胶填充柱的超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC）得到约 50%的更高浓度。利用超临界CO2重复提取2次可获得含量为68%的角鲨烯。对脱臭物皂化后，直接使用正己烷分离，可获得97%的植物甾醇。利用溶剂提取再结合硅胶填充柱超临界流体色谱（Si-gel-SFC）可从非皂化物中得到81%和100%高纯度角鲨烯[21]。

3.2.2 非食用油中提取

植物角鲨烯的研究开发目前已成为国内角鲨烯研究的热点。新发现的产角鲨烯的植物有罗汉果、糯米香茶、尾巨桉、梅树、省沽油，含量最高的为苋属植物的种子。

专利CN1670005C用有机溶剂浸取出罗汉果的破碎种仁或种籽中的脂溶性物质，除去有机溶剂后得到角鲨烯含量大于40%的罗汉果角鲨烯粗品。再将罗汉果角鲨烯粗品过硅胶层析柱，用有机溶剂洗脱，收集洗脱液无色部分，并用减压蒸馏法除去有机溶剂，即得角鲨烯含量大于95%的罗汉果角鲨烯精品[22]。专利CN101417916C公开了一种糯米香茶角鲨烯及其制备方法，将糯米香茶的叶片干燥后粉碎，用有机溶剂或液态CO2浸提出脂溶性物质，除去脂溶性物质中的有机溶剂，即得到糯米香茶角鲨烯粗提物。再将糯米香茶角鲨烯粗提物过氧化铝或硅胶层析柱，用有机溶剂洗脱，即制得含量大于90%的糯米香茶角鲨烯精品[23]。罗汉果角鲨烯和糯米香茶角鲨烯经用气相色谱法或高压液相色谱法、气相色谱-质谱联用仪法、红外光谱法、核磁共振法测定，其图谱均与角鲨烯标准品图谱相符合，且具有角鲨烯特有的香味，均可以替代只能从深海鲨鱼的肝脏中提取出的角鲨烯，并可作为角鲨烯标准品使用。

专利CN1810744A提供了一种从尾巨桉木材中提取角鲨烯的方法，具体步骤为先将尾巨桉木材制成木片或木粉，用有机溶剂从中提取出含角鲨烯的粗提物，其溶剂比（V溶剂/V木）为 3～50∶1，用系统溶剂分离法分离含角鲨烯的粗提物，得到含角鲨烯的烃类混合物，再将含角鲨烯的烃类混合物在1.330 Pa～0.133 Pa真空度下进行2次～5次分子蒸馏，得到含量达80%～90%的角鲨烯产品[24]。专利CN101190281A公开了一种梅树提取物的制备方法，该提取物含有0.5%～50%角鲨烯，其中的角鲨烯主要来自梅树非果实部分的脂溶性有效部位，通过超临界CO2流体或非极性有机溶剂萃取得到[25]。

贾春晓等采用超临界CO2萃取技术对省沽油种子油进行萃取，压力25 MPa，温度50℃，时间2 h。结果表明：超临界CO2萃取种子油的收率为28.83%，省沽油种子油中含4.65%角鲨烯，1.58%维生素E[26]。岳才军等以苋菜叶片为外植体诱导愈伤组织，用皂化和不同有机溶剂浸泡的方法提取苋菜愈伤细胞中角鲨烯，并用HLPC测定其含量，结果表明，皂化法提取苋菜愈伤细胞的角鲨烯含量高于用有机溶剂浸泡方法提取的含量，苋菜愈伤细胞提取的角鲨烯在HLPC上与标准品出峰时间一致，而且该峰与其他峰有很好的分离[27]。Han-Ping He用超临界CO2萃取苋属植物种子油，在50℃、300 bar（30 MPa）时尽管油脂产量较低（2.07 g/100 g），但角鲨烯的产量（0.31 g角鲨烯/100 g种子）和含量（15.3%）却最高[13]。

Ko等对冻干榄仁树落叶的超临界CO2提取物进行了GC-MS和HPLC含量分析，在40℃和3 000 psi（20.67 MPa）压力条件下，超临界CO2提取物中的角鲨烯含量为 1 499 μg/g（12.29%），远高于老叶、成叶、幼叶和种子提取物中的含量，落叶提取物具有较强的抗共轭二烯氢过氧化物（conjugated diene hydroperoxide，CDHP）形成和二苯基苦酰肼基自由基（1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）清除活性，而种子提取物仅表现出较强的抑制CDHP形成作用和很低的DPPH清除活性[28]。

3.3 微生物来源的角鲨烯

动物来源的角鲨烯需要捕杀深海鱼类，存在资源日益枯竭和生态平衡日益破坏的问题。于是人们将目光转向用食用油脂及其副产物为原料提取角鲨烯，已被大量应用的为棕榈油和橄榄油，虽部分地解决了原料来源问题，但又开始与人类争夺食物。因副产品和渣油的综合利用存在量小、不易扩大规模等问题，使得人们的视角转向利用非食用油脂植物资源开发角鲨烯，但非食用油脂植物存在种植面积小、不易收集、周期长的缺点。因此，利用微生物发酵生产角鲨烯液成为关注的焦点。

印度学者P.Bhattacharjee等在通气条件下，对面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）和分离自糖蜜的戴尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）菌株发酵培养，角鲨烯的产量分别为41.16和237.25 μg/g（相对于干菌体），在 60 ℃、250 bar～255 bar（25 MPa～25.5 MPa）CO2流量为0.2 L/min的条件下，对菌株Torulaspora delbrueckii的培养物进行提取，角鲨烯的产量相对于酵母细胞最大为11.12 μg/g（干重），提取前对酵母细胞进行预冻，可将角鲨烯的产量提高到430.52 μg/g（细胞干重），该产量远高于氯仿-甲醇（2∶1）溶剂提取的得率[29]。

Chang等分离自海洋的一株产角鲨烯和多种不饱和脂肪酸的酵母菌株，rDNA分析的结果为Pseudozyma属真菌，与Pseudozyma rugulosa和Pseudozyma aphidis有98%以上的遗传同源性，其发酵的最佳碳源为葡萄糖，在葡萄糖和酵母提取物比例为4.5时角鲨烯的产生被激活，且为产角鲨烯的最佳比率，产角鲨烯的最佳葡萄糖浓度为4 g/L，最佳氮为硝酸钠，此时菌体生物量为5.20 g/L，角鲨烯产量340.52 mg/L。其角鲨烯产量高于以往报道的产角鲨烯菌株，为商业化生产角鲨烯的较佳候选[30]。Walker等发明了一种酵母制备的角鲨烯和利用酵母生产角鲨烯的方法，通过利用基因修复寡核苷酸酶对酵母的一个或多个基因进行修饰达到对酵母进行基因改造的目的。对酵母基因的改造提高了角鲨烯相关的酶的表达，如乙酰辅酶A羧化酶、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、角鲨烯环氧酶和角鲨烯合成酶，并利用这种基因改造酵母，可生产异戊二烯，尤其是角鲨烯[31]。

综上所述，虽然已有多种获取角鲨烯的来源，但大部分采用超临界CO2提取，在实现物料前处理、规模化生产及降低成本方面仍存在诸多限制。目前，亚临界、循环超声等技术在油脂提取方面都应用与推广，角鲨烯的制备技术将有望新的突破。

4 展望

4.1 新型产油植物和产油微生物的发展

植物性角鲨烯来源中，虽然橄榄油和棕榈油可实现规模化生产，以提供生产角鲨烯的原料。但这两种油脂均为食用油脂，虽不存在安全和生态环境问题，但存在与人争食的问题。以其加工过程的废弃物脱臭馏出物或渣油作原料将是废物利用的途径。尽快开发富含角鲨烯的非食用油来源，如苋属植物等，将是真正解决角鲨烯植物来源的根本途径。

利用微生物发酵生产角鲨烯虽然产量较低，其发酵工艺、生长代谢调控，尤其是生产菌株、工程菌株的获得还存在很多的技术困难，但利用微生物生产油脂有可再生性和低成本等特点，开发微生物油脂资源获得角鲨烯产品将更有直接的社会与经济价值。

4.2 角鲨烯代谢过程关键酶的研究

通过基因工程手段改造角鲨烯相关基因，利用基因修复寡核苷酸酶对多个基因进行修饰改造，以提高角鲨烯相关酶的表达，可促进异戊二烯的产生，进而可提高微生物体内角鲨烯的积累。利用生物技术生产角鲨烯虽然面临诸多的挑战，但却是前景诱人的一条出路。

4.3 角鲨烯的人工合成

二十世纪八十年代，日本科学家首先人工合成了角鲨烷[32]，并以Salangane SK为商品名进行了短期销售，但由于其生产成本高昂，后期未见相关报道。因此，如何降低人工合成的生产成本也是解决角鲨烯资源短缺的一个重要途径。

[1] Mitsumaru Tsujirnoto.Squalene:A Highly Unsaturated Hydrocarbon in Shark Liver Oil[J].The Journal of Industrial and engineering Chemistry,1920,12(1):63-72

[2] IM Heilbron,A Thompson.The unsaponifiable matter from the oils of elasmobranch fish.Part VI.The constitution of squalene as deduced from a study of the decahydrosqualenes[J].Journal of the Chemical Society,1929:883-892

[3] Langdon R G,Bloch K.The utilization of squalene in the biosynthesis of cholesterol[J].J Biol Chem,1953,200(1):135-144

[4] Yamaguchi T,Nakagawa M,Hidaka K,et all.Potentiation by squalene of antitumor effect of 3-[(4-amino-2-methyl-5-pyrimidinyl)methyl]--1-(2-chloroethyl)-nitros ourea in a murine tumor system[J].Japanese Journal of Cancer Research,1985,76(10):1021-1026

[5] Eleni Naziri and Maria Z.Tsimidou.Formulated Squalene for Food Related Applications[J].Recent Pat Food Nutr Agric,2013,5(2):83-104

[6] R Amarowicz.Squalene:A natural antioxidant[J].European Journal of Lipid Science and Technology,2009,111(5):411-412

[7] Kohno Y,Egawa Y,Itoh S,et.al.Kinetic Study of Quenching Reaction of Singlet Oxygen and Scavenging Reaction of Free Radical by Squalene in n-butanol[J].Biochem Biophys Acta,1995,1256(1):52-56

[8] A Ramirez-torres,C Gabas,C Barranquero.Squalene:Current Knowledge and Potential Therapeutical Uses[M].New York:Nova Science Pub Inc,2010:1-73

[9]Auffray B.Protection against singlet oxygen,the main actor of sebum squalene peroxidation during sun exposure,using Commiphora myrrha essential oil[J].International Journal of Cosmetic Science,2007,29(1):23-29

[10]Christopher H Clegg,Richard Roque,Lucy A Perrone,et al.GLAAF,an Emulsion-Free Vaccine Adjuvant for Pandemic Influenza[J].PLoS One.2014；9(2):e88979.Published online Feb 14,2014.doi:10.1371/journal.pone.0088979

[11]Andrei Maksimenko,Franco Dosio,Julie Mougin,et al.A unique squalenoylated and nonpegylated doxorubicin nanomedicine with systemic long-circulating properties and anticancer activity[J].Proc Natl Acad Sci U S A.Jan 14,2014；111(2):E217-E226.Published online Jan 2,2014.doi:10.1073/pnas.1313459110

[12]Painter L R,Attrey J S,Hubbell H H,et al.Vacuum ultraviolet optical properties of squalane and squalene[J].Journal of Applied Physics,1984,55(3):756-759

[13]He H P,Corke H,Cai J G.Supercritical carbon dioxide extraction of oil and squalene from Amarantus grain[J].J Agric Food Chem,2003,51(27):7921-7925

[14]Suarez M,Gonzalez P,Dominguez R,et al.Identification of organic compounds in San Diego de los Banos Peloid(Pinar del Rio,Cuba)[J].J Altem Complement Med,2011 Feb；17(2):155-65.Dio:10.1089/acm.2009.0587.Epub 2011 Feb 10.

[15]P Bhattacharjee,V B Shukla,R S Singhal,et al.Studies on fermentative production of squalene[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2001,17(8):811-816

[16]滨州学院.酵母油脂及其制备方法和应用:中国,ZL:201010571272.9[P].2013-07-31

[17]官波,郑文诚.角鲨烯提取、纯化及其应用[J].粮食与油脂,2010(2):44-46

[18]Owen J.Catchpole,Jan-Christian von Kamp,and John B.Grey.Extraction of Squalene from Shark Liver Oil in a Packed Column Using Supercritical Carbon Dioxide[J].Ind Eng Chem Res,1997,36(10):4318-4324

[19]天津大学.以橄榄油为原料提取高纯度角鲨烯的方法:中国,CN101597204A[P].2009-12-09

[20]美国田纳西州伊斯曼化学公司:回收植物脂质组合物的方法:中国,CN1849331A[P].2004-09-01

[21]Sugihara N,Kanda A,Nakano T,et al.Novel fractionation method for squalene and phytosterols contained in the deodorization distillate of rice bran oil[J].Journal of Oleo Science,2010,59(2):65-70

[22]广西师范大学.植物角鲨烯及其制备方法:中国,CN1670005C[P].2004-03-18

[23]中国热带农业科学院分析测试中心.糯米香茶角鲨烯及其制备方法:中国,CN101417916C[P].2007-10-26

[24]华南农业大学.一种制备角鲨烯的方法:中国,CN1810744A[P].2006-02-23

[25]杭州尤美特科技有限公司,新时代健康产业(集团)有限公司.梅树提取物及其制备方法和用途:中国,CN101190281A[P].2006-11-27

[26]贾春晓,毛多斌,杨靖,等.省沽油种子超临界CO2萃取物中角鲨烯和维生素E的GC-MS分析[J].天然产物研究与开发.2007,19(2):256-258

[27]岳才军,何彦平,阮洪生,等.苋菜培养细胞中角鲨烯的提取与含量测定[J].安徽农业科学,2010,38(10):5104-5105

[28]Ko T F,Weng Y M,Chiou R Y.Squalene Content and Antioxidant Activity of Terminalia catappa Leaves and Seeds[J].J Agric Food Chem,2002,50(19):5343-5348

[29]P Bhattacharjee,R S Singhal.Extraction of squalene from yeast by supercritical carbon dioxide[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2003,19(6):605-608

[30]Mi-Hee Chang,Hyeon-Jin Kim,Kwang-Yeop Jahng,et al.The isolation and characterization of Pseudozyma sp.JCC 207,a novel producer of squalene[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2008,78(6):963-972

[31]Walker K A,Fong Noel M,Knuth,Mark E,et al.Production of squaleneusingyeast:UnitedStationPatentApplication:20090298150[P].2009-12-03

[32]Nishida T,Ninagawa Y,Itoi K,et al.New industrial synthesis of squalane[J].Bulletin of the Chemical Society of Japan,1983,56(9):2805-2810