侯惠静，王素英，*，郭斌辉

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134；2.天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

基于DNA特征的蓝藻分类方法研究进展

侯惠静1，2，王素英1，2，*，郭斌辉1，2

（1.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134；2.天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

传统的形态学分类标准较模糊以及蓝藻的形态易变等问题造成了传统形态分类方法难以准确地对蓝藻进行分类。新的分子生物学的方法已经被用于解读遗传信息和完善蓝藻的分类系统。当今，蓝藻的系统分类研究及其基因型研究主要依靠基于DNA特征的分子分类方法，并且获得了很好的结果。本文归纳总结了多种基因DNA特征的分子分类方法及特征性标记基因在蓝藻分类中的应用，并且对蓝藻的分类研究进行了展望。

蓝藻；分子分类；DNA指纹识别；标记基因

以形态特征或细胞内超微结构为依据的形态学方法在蓝藻的分类鉴定历史中起了非常重要的作用。但是随着人们对蓝藻的深入研究以及新藻种的不断出现，传统的形态学分类法愈加显示出它的局限性，主要原因如下：首先，蓝藻有些属种之间的形态特征区别并不明显，如Synechoccous和Cyanoothece在形态上就非常接近[1]，而且蓝藻的形态又受到诸多生长条件（生长的温度、时间、光照强度、营养以及pH等）的影响，如节旋藻TJSD在不同培养温度、光照或pH条件下，藻丝体的长度、螺旋数、螺距都有较大的变化[2]，因而形态学上界定蓝藻所依据的标准非常模糊；其次，蓝藻个体通常微小，普通光学显微镜下难以参照形态标准进行辨别，即便是富有经验的专家借助电子显微镜也很难准确地对一些物种的形态特征进行完整的描述；此外，不同学者自身研究领域的局限性以及形态学分类标准优先权的不统一性造成了目前多种分类系统并存且不一致的局面，例如：1985年Anagnostidis和Komarek依据形态学方法将蓝藻分为四目：念珠藻目（Nostocales）、真枝藻目（Stigonematales）、色球藻目（Chroococcales）和颤藻目（Oscillatoriales）[3]；20世纪40年代中期，英国藻类学家Fritsch FE根据形态学又将蓝藻分为五类，不仅包括前面四类，还包括宽球藻目（Pleurocapsales）[4]。因此形态学分类往往导致蓝藻在属内种水平、属水平以及品系水平上的分类与命名混乱或争议[5]。如2001年Gugger等[6]利用16SrRNA、16S-23SITS和rbcLX发现鱼腥藻属（Anabaena）和束丝藻属（Aphanizomenon）不能独立的分为两类，他们在系统发育树中互相交叉，表明蓝藻在以传统的形态特征为基础的分类上存在问题[7]，2009年Valério等[8]利用16S rRNA得到了与Gugger一致的结果。这种状况不仅制约蓝藻的理论研究与学术交流，而且严重影响国内外微藻产业的进一步发展。

相对于形态学分类方法，基于DNA特征的分子分类能够更好地反应物种之间的亲缘关系，因此找寻那些不受环境因素影响的特殊标记分子及其分类方法，探索新的更加稳定的种属鉴定标准也就成为蓝藻研究的热点领域之一。

1 DNA指纹识别技术

1985年Jeffrey等建立了利用卫星DNA作探针，探测不同生物的卫星区，进而直接检测DNA差异的DNA指纹图谱技术[9]。WenTas.L等[10]及U.Nubel[11]等比较了基于PCR的指纹识别技术（RFLP，RAPD，DGGE，SSCP）的不同。2000年Casamayor等[12]的研究表明DGGE技术可以检测到整体群落中超过1%的一个亚种群。2003年Crosby和Cridd le的研究表明基于16S rRNA的指纹技术与基于ITS区的自动核糖体间隔基因分析技术 （automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA）[13]，以及末端限制性片段长度多态性技术（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）在某些状况下可以更好地估计种群多样性[14]。

1.1 限制片段长度多态性技术

限制片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技术是最早发展起来的分子标记技术，具有重复性好、共显性强、多态性信息量大及不受环境和物种发育阶段影响的优点。1996年Neilan等[15]以编码藻蓝蛋白的β亚基（β-phycocyanin subunit，cpcB）和α亚基（α-phycocyanin subunit，cpcA）以及两者之间的间隔序列（intergenic spacer region，cpcBAIGS）作为分子标记，通过RFLP技术成功地对19株蓝藻（包括：6株德国卷曲鱼腥藻属藻株、6株铜绿微囊蓝藻属藻株以及7株泡沫节球藻属藻株）进行了准确的分类与鉴定；2002年Iteman等人[16]也利用该技术，并以16S rRNA作为分子标记，对11株浮游藻株和念珠藻属的PCC 7120进行了鉴定，并指出4株项圈藻属（Anabaenopsis）藻株及2株蓝螺菌属（Cyanospira）藻株的亲缘关系十分接近，也能与节球藻属（Nodularia）PCC9350归为一类，而项圈藻flos-aquae和束丝藻株（Aphanizomenon）属于不同的分支。刘丽[17]等通过nlsrDNA（nuclear large-subunit ribosomal DNA）及nssrDNA（nuclear small-subunit ribosomal DNA）的RFLP研究发现广东徐闻地区62个造礁石珊瑚样本的共生藻可聚为两类，即C1亚系群与C15亚系群。2012年刘庆等[18]用16S-23S rRNA基因间隔区ITS序列作为生物标记，通过T-RFLP技术对富营养化严重的滇池、巢湖和太湖的蓝藻样品进行分析，共得到36个不同的末端限制性酶切片段，反映出3个湖泊中的种群具有丰富的基因多样性，且所研究的湖泊中的蓝藻种群结构存在空间差异，其中滇池和巢湖的种群结构类似。

1.2 随机扩增多态性技术

随机扩增多态性（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）由Williams等于1990年提出，利用该方法可以简便、灵敏地检测出基因组DNA的多态性[19]。1997年Nishihara等[20]首次将RFLP技术应用于蓝藻的分类研究中。2005年Prabina等[21]利用RAPD技术对17株蓝藻进行了研究，并且发现RAPD技术可有效的检测蓝藻藻株是否为纯种。2002年李晋楠等[22]首次将RAPD技术用于螺旋藻的分类，用106条随机引物对7株钝顶节旋藻的基因组进行了RAPD研究，经聚类分析表明：7株藻聚为两类，且与7株藻的生理生化和分子生物学特性相一致，为螺旋藻的分类系统的完善奠定了解出提供了依据。

1.3 扩增片段长度多态性技术

扩增片段长度多态性（amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP）专一性强、可靠性高，还可在不知道基因组序列的情况下对物种进行研究[23]。2000年Kusumo等[24]利用AFLP技术揭示了不同采样时间及地点的翅藻（Alariamarginata）的遗传差异，其研究结果表明不同采样季节所得到的翅藻属种具有遗传差异，各翅藻属种的遗传距离与其空间分布距离呈正比关系。2005年Muller等[25]采用AFLP技术结合ITS序列分析技术对比分析了小球藻藻株之间的分类差异。

1.4 变性梯度凝胶电泳技术

变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）技术操作简便、快速，加样量小，重复性好，还可以用来研究微生物群落的时空分布及组成，确定复杂样品的特定DNA序列[26]。2001年Coyne等[27]利用PCR-DGGE技术鉴定分析了几株形态学上极其相似的弑鱼藻，并且对比了普哥木河和德拉维尔内海湾弑鱼藻的群落结构差异。2011年邵娟等[28]利用DGGE技术有效地确定出7种常见的海洋赤潮藻类的差异，同时鉴定了赤潮样品中4种优势种。这些研究的结果都表明DGGE技术可作为一种辅助方法用于蓝藻的分类鉴定。

1.5 STRR和LTRR指纹技术

重复序列是蓝藻基因组中重要的部分。1990年Mazel等[29]利用从眉藻PCC7601株中分离出的STRR序列（Short Tandemly Repeated Repetitive）与异型胞株的基因组DNA杂交，通过分析杂交的带形，在种和属的水平上鉴定了这些藻株，并对STRR在蓝藻系统分类中的应用进行了探讨。Rasmussen和Svenning[30]指出基于STRR和LTRR（Long Tandemly Repeated Repetitive）的指纹技术可用于蓝藻的分类研究中。

1.6 单核苷酸多态性技术

迄今为止，单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）技术在藻类分类中的应用还较少。2003年Batley等[31]发现在500个Nodularia（Cyanobacteria）藻株的基因组中，有3个基因位点（即，16S-23S基因间隔区ITS、藻蓝蛋白基因间隔区PC-IGS、编码气囊主要结构蛋白的基因gvpA）表现出了良好的单核苷酸多态性，其中约97%的藻株，这3个基因位点的SNP表现为同一基因型，2.4%的藻株，只有两个基因位点表现为同一基因型，他们的研究结果说明该方法适用于含有大量个体的群体遗传学研究。

DNA指纹技术以DNA特征结构为依据，具有快速且分类结果能够较好反映亲缘关系的特点，但这些技术也存在诸多问题。如：（1）DGGE得到的单基因序列长度为200 bp～700 bp左右，信息比较有限，难以进行精确的系统发生分析[32]；不同序列的DNA有可能迁移到胶的同一位置[33]；或者由于有些物种基因的不同拷贝之间存在异质性问题会出现多个条带，过高地估计环境中微生物的多样性；（2）RAPD技术由于扩增目标是随机的，因此重复性较差；（3）AFLP标记需要同位素检测，对提取的DNA纯度和内切酶质量要求严格，成本较高；（4）RFLP技术成本较高，步骤繁琐，检测周期长，需要同位素标记，在一般实验室难以操作等。另外，大部分分子分类方法都是通过提取样品的DNA或者RNA，再利用PCR扩增技术获得特定基因片段，继而进行系统发育分析，因此，DNA样品提取是否成功、PCR抑制物的出现、引物特异性及扩增效率等问题，也会影响到分类鉴定的结果[34]。

2 特征性标记基因的序列分析

从本质上说，生物个体的差异取决于其遗传物质基因组DNA。因此，对生物个体进行分类和鉴定最可靠、直接而有效的手段是对生物基因组进行测序从而比较个体差异[35]。但生物基因组DNA较大，对每种生物的基因组进行测序在财力、物力、人力的消耗上将非常巨大。如gloeobacter violaceus PCC7421是一种无类囊体蓝藻，它的基因组为一环状染色体，长度为4 659 019 bp[36]；念珠藻（nostoc punctiforme）ATCC29133的基因组接近10Mb[37]。因此对于一般物种的分类研究，在传统分类的基础上选择有代表性的基因片段作为分类标准，并用不同的分子标记技术来区分群体之间、属种之间的遗传差异就成为当前研究的主要方向。

2.1 16S rRNA基因及ITS区

16S rRNA基因序列保守性较高，有“生物进化分子钟”之称，常用于揭示属及属以上水平的系统发生关系。16S-23S rRNA转录单位内间隔区序列（ITS）在生物进化过程中的变异程度一般比16S rRNA基因序列高，具有长度和序列上的高度变异性，可以提供丰富的变异位点和信息位点，可用作分子标记对较低阶元进行分类与亲缘关系研究[38-39]。在高等植物中已经被广泛用作研究进化系统的重要分子标记[40]。

Suda用16S rRNA基因序列将供试的75个蓝藻株系分为6个组群[41]。茅云翔利用16SrRNA基因和16S-23S rRNA基因的ITS区对螺旋藻和节旋藻进行了系统发生分析，认为在这两个基因位点上能够将螺旋藻和节旋藻区分开，这一结果与刘金姐的研究结果相同[42-43]。

1994年Nelissen等[44]利用16S rRNA基因序列对螺旋藻和节旋藻进行分类与鉴定时发现SpirulinaPCC6313与单细胞蓝藻Synechococcus PCC7002聚为一类，之后茅云翔[45]、Ballot等[46]的研究证实了这一结果。

2.2 藻蓝蛋白基因

藻蓝蛋白是红藻和蓝藻中一种重要的捕光色素蛋白，基因全长1 119 bp，其中β亚基基因序列长度为519 bp位于α亚基基因上游，中间有111 bp的间隔序列。2002年于平等[47]发现极大螺旋藻和其他藻类的藻蓝蛋白氨基酸序列的同源性在45.9%～99%之间，藻蓝蛋白α和β两个亚基的氨基酸序列同源性为27.1%。藻蓝蛋白包含许多疏水性氨基酸，这些疏水性氨基酸在藻胆蛋白的聚集过程中起着极为重要的作用。因此，藻蓝蛋白基因序列及间隔区序列可以用于蓝藻的分类研究。

2005年teneva等[48]使用cpcBA-IGS序列对林氏念珠藻和点状念珠藻进行了系统发育分析，结果显示念珠藻属是异质性的。2010年Tan等[49]以cpcBA-IGS序列为分子标记，对中国的13株惠氏微囊藻（Microcystiswesenbergii）进行了分类研究，构建的系统树显示，惠氏微囊藻聚为一群，表明cpcBA-IGS可以把惠氏微囊藻和其它微囊藻区分开。黄家权等对四种鱼腥藻的部分藻蓝蛋白基因及cpcBA-IGS序列进行了全细胞PCR扩增，通过序列分析表明，cpcBA-IGS序列可作为鉴定种及种以下的分类依据[50]。

2.3 rbcL和rbcS基因

1987年，Ritlandh和Clegg等首先提出rbcL基因可用于系统发育研究[51]。rbcL（Rubisco largesubunit）基因编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶加氧化酶的大亚基，长约1.4 Kb。该酶催化光合作用中CO2的固定，由8个大亚基（rbcL）和8个小亚基（rbcS）组成，rbcX位于rbcL与rbcS之间，可能具有分子伴侣的功能[52]。rbcLX由rbcL基因的3’端，非编码间隔序列，以及rbcX的5’端组成。由于rbcLX序列既有保守的编码序列也有快速进化的片段，对近缘蓝藻有较强的分辨能力。

2003年刘金姐等[53]测定了节旋藻的rbcL基因序列，并与GenBank数据库中已经报道的部分蓝藻的核苷酸序列进行了同源性分析，结果表明利用rbcL基因位点可以明确的将节旋藻和螺旋藻区分开，这与茅云翔等报道的结果一致。2005年Rajaniemi等[54]基于rbcLX基因序列对念珠藻、鱼腥藻的系统发育关系进行了研究，发现念珠藻为单系起源。2011年王捷[55]利用rbcL基因成功将念珠藻进行了分类。

rbcL基因在不同类群中的进化速率有较大的差异，但总的来说相对保守，rbcL序列还具有一些独特的优点：以单拷贝形式存在，不发生基因转变；序列较长，能提供较多的分子性状等[56]。虽然有学者指出rbcL序列可能在不同物种间发生了水平转移，但该序列作为系统进化研究的分子标记仍然在被研究者使用，并得到了很好的启发性的研究结果[57]。

2.4 psbA基因

psbA基因是蓝藻叶绿体基因组中的一个重要光调控基因，其编码产物是32 ku的D1蛋白，是光系统Ⅱ反应中心的2个核心蛋白之一，在光合作用中介导电子传递[58]。陆生植物的psbA基因一般是无内含子的单拷贝基因，藻类的情况相对复杂，一般有内含子，且含有2个或多个拷贝，如莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii，2个拷贝）和纤细裸藻（Euglenagracilis，1个拷贝）中均有4个内含子[59-60]。但也有些藻类的psbA基因与高等植物的psbA基因相似，如小球藻不含内含子，全长1 060 bp。

psbA基因编码区序列的同源性在双子叶植物之间超过90%，而在藻类中一般为84%～90%[61]。由于psbA基因高度保守，因此广泛用于较高水平如属以上水平的分子系统发育关系的比较[62]，如在藻类中用psbA序列探讨双鞭毛藻质体的起源等[63]。

2008年吴晓微等[64]通过研究8株小球藻的psbA基因序列发现，基因间相似性为83.3%～98.8%，除了其中2组关系极近的小球藻相似性高达98%之外，其他两两之间相似性为83%～93%，而其编码的氨基酸序列间的相似性超过95%。

2.5 其他标记基因

gyrB基因编码DNA促旋酶β亚基，进化速率比16S rRNA快，包含更多的遗传变异信息，是细菌种属分类的有效分子标记。

在藻胆蛋白中，与其α、β亚基同步进化的还有3种连接亚基的棒状连接多肽基因CpcH，Cpc I和CpcD，它们均由一个祖先基因“TEA（terminalenergyacceptor）”演化而来。基于这一原理，2006年杨灵勇等[65]首次尝试以CpcHID（由CpcH、CpcI和CpcD基因组成的操纵子序列）为分子标记，对钝顶节旋藻品系进行亲缘关系和分类学研究，发现其进化趋势与16S rRNA和ITS的相一致，可作为节旋藻分类与鉴定的一种新的分子标记。

2013年Prashant Singh等利用nifH基因证实了念珠藻属（Nostoc）和项圈藻属（Anabaena）为两个类群的分类结果[66]。2004年张晓辉等[67]首次将氢化酶大小两个亚基 hoxH和 hoxY的基因应用到节旋藻属（Arthrospira）和螺旋藻属（Spirulina）的系统学分析中。通过比较两个基因的核苷酸序列及其对应的氨基酸序列发现：螺旋藻属明显区别于节旋藻属，并与茅云翔和刘金姐的分类结果一致。2002年Barker等[68]同时利用相邻拷贝的结构气泡（structural gas vesiele）基因的间隔非编码区（gvpA-IGS）、藻蓝蛋白基因内间隔区（cpcBA-IGS）和rDNA内部转录间隔区（rDNA-ITS）三个位点对固氮蓝藻进行了系统发生分析。

3 结论

综合前人基于DNA分子对蓝藻进行的分类研究，不难发现尽管研究者选用的DNA指纹图谱技术不同，选择的特征性标记基因不同，但对蓝藻的分类结果相互弥补、彼此印证，说明DNA序列变异是客观标准，以此为依据的分子分类可以弥补传统形态分类存在的不足，能为蓝藻的鉴定以及分类研究提供更准确的依据，蓝藻的分类体系也日趋完善，且更接近于物种的自然亲缘关系。

用于蓝藻分类和鉴定的分子标记技术较多，但每种技术或每个标记基因反映的变异仅代表基因组DNA变异的一小部分，因此笔者认为在实际应用中采用单个分子标记技术或标记基因很难对蓝藻的亲缘关系进行准确的判断，必须充分利用各种标记技术及标记基因的特点，采用互补的多种标记技术及标记基因来进行系统发育分析，以获得能够反映生物进化过程中蓝藻不同物种之间亲缘关系的分类系统和标准。另外，用于蓝藻分类的不同特征基因参与的生命过程不同，进化速率不同，其保守性也不同，在属及属以上水平进行分类时可以选取在进化上相对保守、与蓝藻生存息息相关的基因，例如16s rRNA及与光合作用相关的基因cpcB、cpcA、psbA等；在进行属以下的系统发育分析时可以利用进化速率相对较快的序列，如ITS、cpcBA-IGS等。

通过对螺旋藻（节旋藻）分类系统的重建研究中发现螺旋藻（节旋藻）的形态具有多变性，温度，PH对其螺距影响较大，且大部分螺旋藻藻株很难被富集，挑取单藻丝获得纯培养比较困难。所以形态分类虽然具有简单快速的特点，但在无法获得纯培养的情况下也很难进行分类鉴定，而分子分类方法不用，可以通过宏基因组学对环境中的螺旋藻（节旋藻）样本DNA进行研究，可以从本质上揭示环境中螺旋藻（节旋藻）的生物多样性，才能为螺旋藻（节旋藻）的开发利用提供可靠的信息。因此，在分类研究中需要选择多种分子标记技术及特征性标记基因对该物种进行全方位的系统发育分析，并结合形态学和生理特征，如此才有可能建立一套快速、准确、适用于蓝藻的分类鉴定技术和能够反映亲缘关系、指导鉴定实践的稳定分类系统。

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Reseach Advances in Cyanobacterial Taxonomy Based on DNA Character

HOU Hui-jing1，2，WANGSu-ying1，2，*，GUO Bin-hui1，2
（1.Schoolof Biotechnologyand Food Science，Tianjin UniversityofCommerce，Tianjin 300134，China；2.Tianjin Key LaboratoryofFood Biotechnology，Tianjin 300134，China）

Accurate classification of cyanobacteria using traditionalmorphological taxonomy is challenging due to theobscurity ofmorphological criteria andmorphousvariability.New approaches from molecular biology have been utilized to decode genetic information and to improve cyanobacterial taxonomy.Nowadays，use of taxonomy based on DNA character to classify cyanobacteria and further tostudy theirgenotypic relationshipsare underway，and obtained resultsare promising.The application of variousmolecular classificationmethodsand distinctive mark genes in cyanobacterial categorization have been reviewed，and also recent advances in cyanobacterial categorization.

cyanobacteria；Molecular taxonomy；DNA fingerprinting；markergene

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.035

2014-09-01

国家自然科学基金（31270050）；天津市高等学校创新团队项目（TD12-5049）；国家大学生创新训练计划项目

侯惠静（1989—），女（汉），在读研究生，研究方向：微生物前期开发与利用。

*通信作者：王素英（1964—），女（汉），教授，博士，研究方向：微生物开发与利用。