李钻芳，刘安娜，陈文列，2，曾 红，黄 燕，丁 晨，吴宗艺

(1. 福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.国家中医药三级科研实验室(中药药理实验室)，福建福州350122;3.福建师范大学生命科学学院，福建福州350122)

应用草履虫进行雷公藤急性毒性实验的意义

李钻芳1，刘安娜1，陈文列1，2，曾 红3，黄 燕1，丁 晨1，吴宗艺1

(1. 福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州350122；2.国家中医药三级科研实验室(中药药理实验室)，福建福州350122;3.福建师范大学生命科学学院，福建福州350122)

目的 以草履虫为研究对象进行雷公藤急性毒性实验。 方法 雷公藤浓度70 ～230 mg/mL，组距10mg/mL，体式显微镜下观察记录1、3、6 h草履虫的活动性和死亡数。 结果 雷公藤作用1、3、6 h的安全浓度为110、100、80 mg/mL；最大耐受浓度为120、110、90 mg/mL；致死浓度为130、120、100 mg/mL；半数致死浓度为172.1、156.8、147.8 mg/mL；雷公藤浓度为210 ～220 mg/mL时，草履虫全部死亡。 结论 草履虫进行雷公藤急性毒性实验，1～6 h其死亡率与药物浓度呈正相关，实验方法简便。

雷公藤；急性毒性实验；草履虫

雷公藤俗称断肠草，具有清热解毒、祛风通络、杀虫止血的功效[1]。目前的雷公藤急性毒性实验使用小鼠等哺乳类实验动物培养的人体或动物体细胞或组织模型系统[1-4]，实验周期较长，条件要求较高，成本高。草履虫生长迅速，生长周期短，取材容易，培养方法简单，实验成本低廉。它既是动物也是细胞，具备完整的生命过程的所有物质基础和结构基础。因此，常作为生理学、细胞学、遗传学的科学研究模式生物和教学实验材料，也是生态毒理学实验的好材料。已有利用单细胞动物草履虫来进行制药废水[5-6]、三聚氰胺[7]、防腐剂苯甲酸钠[8]的毒性实验、麻醉药的麻醉作用实验[9]的报道。本研究借鉴上述实验，用草履虫进行雷公藤的急性毒性实验，探讨将原生动物作为药物快速急性毒性实验的可行性，并作为中药安全性实验的辅助性指标。

1 材料与方法

1.1 材料 ① 稻草培养液：干净无霉变稻草芯，剪成2～3 cm小段，按每5 g稻草芯加800 mL水的配比煎煮10 min。稻草液连同稻草倒入干净烧杯中，双层纱布封口，常温放置24 h备用。② 草履虫培养：实验用的草履虫为原生动物纤毛类草履科的尾草履虫，由福建师范大学生命科学学院提供。将200 mL新鲜稻草培养液连同稻草放入锥形瓶，用移液管吸取10 mL含草履虫的培养液至锥形瓶中，用纱布封口，置22℃、66% 光照条件的培养箱进行培养，1周后用于实验。③ 雷公藤浓缩液：取雷公藤饮片(毫州市贡药饮片厂，生产批号：140308)均匀木质部和皮部100 g，加2 000 mL水浸泡30 min，煎煮2 h，过滤，浓缩至50 mL，每1 mL药液含2 g生药量，杀菌，分装冷冻。

1.2 急性毒性实验 调节稻草液pH为6.8～7.0。在24孔培养板中，配制雷公藤浓度60 ～230 mg/mL，组距为10mg/mL，每个浓度设置3个平行组，并设不含药物的空白对照组。用滴管吸取2滴含草履虫的稻草液至载玻片上，在体式显微镜观察下，用2μL微量移液器吸取10只草履虫放入各培养孔中，毒性实验时间为1、3、6 h。用写字画一法，将孔中所有药液均匀连续地在载玻片上挤出，在显微镜下观察、记录草履虫的运动性和死亡数。

1.3 数据分析 ① 安全浓度、最大耐受浓度、致死浓度：根据实验数据，草履虫未出现死亡，但是运动性相对空白组较弱的浓度为最大耐受浓度，安全浓度比最大耐受浓度小1个组距，草履虫出现死亡的浓度为致死浓度。② 半数致死浓度：利用概率单位法求半数致死浓度LC50。根据急性毒性实验数据中相应死亡数求出死亡率，查概率单位表可知死亡率的概率单位，求得各个浓度对应的浓度对数。用数学模型绘制出概率单位(Y)与浓度对数(X)的回归曲线图，得到回归曲线方程。半数致死浓度的死亡率为50%，对应的概率单位为5，带入回归曲线方程可求出半数致死浓度对数，再算出半数致死浓度。

2 结 果

实验结果 见表1～表3。

药物浓度对数(X)与概率单位(Y)的回归方程：

Y=16.267X-31.37r=0.9902

求得LC50为172.11 mg/mL。

雷公藤药液作用1 h的安全浓度110 mg/mL，最大耐受浓度120 mg/mL，致死浓度130 mg/mL，半数致死浓度LC50172.11 mg/mL。

表1 雷公藤作用1h的急性毒性实验

表2 雷公藤作用3h的急性毒性实验

药物浓度对数(X)与概率单位(Y)的回归方程：

Y=13.17X-23.911r=0.9962

求得LC50为156.75 mg/mL。

雷公藤药液作用3 h的安全浓度100 mg/mL，最大耐受浓度110 mg/mL，致死浓度120 mg/mL，半数致死浓度LC50156.75 mg/mL。

药物浓度对数(X)与概率单位(Y)的回归方程：

Y=11.264X-19.44r=0.9958

求得LC50为147.82 mg/mL。

雷公藤药液作用6 h的安全浓度80 mg/mL，最大耐受浓度90 mg/mL，致死浓度100 mg/mL，半数致死浓度LC50147.82 mg/mL。

3 讨 论

3.1 急性毒性实验分析 雷公藤浓度在60 ～200 mg/mL，作用 1～6 h，药物浓度与草履虫死亡率呈正相关，说明药物浓度越大，药物毒性越强；药物作用时间越长，药物毒性作用越明显。药物浓度210 ～220 mg/mL时，草履虫全部死亡。

表3 雷公藤作用6h的急性毒性实验

3.2 本实验与雷公藤的小鼠急性毒性实验或体细胞毒性实验比较 利用小鼠进行雷公藤急性毒性实验[10]中，实验时间大于12 h，所需小鼠在50只以上，而本实验所需的时间短，动物成本低廉。在体细胞毒性实验的报道中，程文超等[3]测得雷公藤甲素对大鼠胰腺泡细胞的半数抑制浓度LC50为0.0017 mg/mL，刘养岁等[4]测得雷公藤甲素浓度为0.1 μg/mL时，胰腺癌PANC-1细胞凋亡率为50%。本实验所得安全性实验数据均大于生药量90 mg/mL，可能由于雷公藤水煎煮液中有效成分的纯度、毒性均较小。

3.3 利用原生动物的特点进行中药急性毒性实验的优势 常规的毒性实验常用大小鼠进行动物实验，但是实验消耗动物量较大，动物饲养条件较高，占用空间大，实验周期长，影响重复性因素多，特别是对于药物的初步快速毒性实验，或有毒物质的筛查，其经济和时间成本都比较高。培养人或动物的体细胞进行中药细胞毒性实验，培养条件苛刻，实验研究要求高、成本高，并需采用血清毒理学方法，使用哺乳类实验动物制备含药血清，且离体的人或动物体细胞并非完整生命有机体。利用原生动物既具有单细胞特性又具有完整生命有机体的特性，进行急性毒性实验，实验效率高，条件要求低，易于培养，成本低廉。

3.4 小结 草履虫与哺乳动物存在很大差别，草履虫药物毒性实验，可作为动物实验的补充，不能替代动物实验来进行药物毒理学研究。通过实验证明利用草履虫进行中药急性毒性实验，实验简单、便捷、快速，主要用于前期的快速毒性或毒性中药筛选，可作为常规中药毒性实验的补充方法。

[1]LI J，LU Y，XIAO C，et al. Comparison of toxic reaction of Tripterygium wilfordii multiglycoside in normal and adjuvant arthritic rats[J]. J Ethnopharmacol，2011，135(2)：270-277.

[2]马嘉，吴新安，都兴东. 雷公藤甲素诱导人肝细胞凋亡的机制[J]. 江苏医药，2013，39(1)：5-8.

[3]程文超，谢卫华，梁永红，等. 雷公藤甲素对大鼠胰腺腺泡细胞的损伤作用[J]. 中国药理学通报，2013，29(12)：1775-1776.

[4]刘养岁，齐敦峰，李欢送，等. 雷公藤甲素诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡及机制的研究[J]. 中华肝胆外科杂志，2012，18(12)：949-951.

[5]GONG ZL，CHEN Y，YAN Y，et al. Toxicity of Three Heavy Metal Pollutants of the Pharmaceutical Wastewater to Paramecium Caudatum[J]. Advanced Materials Research，2014，937：571-577.

[6]SAIB A，BERREBBAH H，BERREDJEM M，et al. Cytotoxic study of three derivatives amidophosphonates on alternative cellular model：Paramecium tetraurelia[J]. Toxicology Research，2014，3(5)：395-399.

[7]王正方，齐小花，邹明强，等. 三聚氰胺对纤毛类原生动物梨形四膜虫的细胞毒性[J]. 生态毒理学报，2009，4(1)：35-36.

[8]ZHOU M，XIA H，XU Y，et al. Anesthetic action of volatile anesthetics by using Paramecium as a model[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32(3)：410-414.

[9]刘俊，李霖，张晓燕. 苯甲酸钠对草履虫的毒性作用研究[J]. 扬州职业大学学报，2011，15(4)：45-48.

[10]白赟，高丽，王永辉，等. 雷公藤醇提物小鼠急性毒性实验[J]. 世界中西医结合杂志，2014，9(2)：138-140.

2015-03-12

福建省教育厅资助课题 (JA11131)

李钻芳(1984-)，男，实验师，主要从事中西医结合基础研究。

R285.5

A

1000-338X(2015)03-0047-03