李德和,王君为,赵 越

(广东药学院中药学院,广东 广州 510006)

响应面法优化类球红细菌中番茄红素提取工艺

李德和,王君为,赵 越*

(广东药学院中药学院,广东 广州 510006)

利用响应面法研究有机溶剂提取类球红细菌中番茄红素的工艺。以每克菌体提取所得番茄红素的量作为响应值，在单因素试验基础上，选取皂化时间、料液比、超声时间及提取次数为自变量，采用响应面法研究各因素及其交互作用对类球红细菌番茄红素提取量的影响并建立了番茄红素提取的回归模型，确定了番茄红素提取工艺的最佳条件为以丙酮为提取溶剂、皂化时间28 min、料液比1∶86（g/mL）、超声时间11 min、提取次数2 次。在此条件下，番茄红素提取量为9 326.48 μg/g。本实验所得工艺方法切实可行，为类球红细菌工业化发酵生产番茄红素的进一步研究提供技术参考。

类球红细菌；番茄红素；提取；响应面法

番茄红素是一种类胡萝卜素，因最早从番茄中分离制得而得名。番茄红素习惯上被认为是一种色素，在众多国家和地区被作为具有营养与着色双重作用的食品添加剂[1]。番茄红素具有抗氧化[2-3]、提高免疫力[4]、预防心血管疾病[5]、预防和抑制肿瘤[6]等多种生理功能，使其在食品、药品或相关保健品以及化妆品、实用色素等领域均有广泛的应用[7]。常用番茄红素生产方法中，微生物发酵法生产成本低，易于大规模培养，产率高，因此被认为是目前生产番茄红素最有前途的方法[8]。因此，建立一种对发酵菌体中番茄红素进行优化的科学合理的提取方法是非常必要的。

目前，番茄红素提取方法主要有溶剂提取法、微波提取法、酶反应法、超临界提取法等[9-12]。有文献[13-14]报道从三孢布拉霉菌、红酵母等菌体中提取番茄红素，但关于类球红细菌中番茄红素提取工艺的报道则甚少。响应面法是目前设计试验建模寻找响应因子最佳条件最为常用的统计学技术[15-16]。因此，本研究通过单因素试验及响应面法设计寻求提取类球红细菌中番茄红素的最佳工艺条件，以期为类球红细菌的综合利用以及类球红细菌工业化发酵生产番茄红素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酵母膏、蛋白胨为国产生物纯，其他所用试剂均为国产分析纯；番茄红素标准品 美国Sigma公司；类球红细菌（编号:1.2174） 中国科学院微生物研究所。

1.2 仪器与设备

UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；BP211D电子天平 德国Sartorius公司；AY120电子天平日本Shimadzu公司；MJ-78A高压灭菌锅 美国Stik公司；SW-CJ-1FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；RXZ人工气候箱 宁波江南仪器厂；3-30K离心机 德国Sigma公司；SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机宁波新芝超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的扩大培养

种子培养基配方:KH2PO41.0 g，CaCl20.1 g，NaHCO33.0 g（过滤除菌），CH3COONa 1.0 g，MgCl21.0 g，NH4Cl 1.0 g，NaCl 1.0 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.5 g，丁二酸钠1.0 g，微量元素液1.0 mL，去离子水1 000 mL。

发酵培养基配方:NH4Cl 0.3 g，CaCl2·2H2O 0.05 g，NaCl 0.4 g，KH2PO41.0 g，Na2CO30.5 g，MgCl2·6H2O 0.2 g，酵母膏1.0 g，微量元素液10 mL，去离子水1 000 mL。

微量元素液配方:Na2-EDTA 2.0 g，H3BO31.5 g，C u S O40.0 3 g，M n S O4·H2O 1.2 g，NaMoO4·2H2O 0.45 g，FeSO4·7H2O 0.2 g，ZnSO4·7H2O 0.15 g，NiCl2·6H2O 0.02 g，去离子水1 000 mL。

人工气候箱培养条件:温度35 ℃、光照4 000 lx、湿度60%。

按种子培养基配方配制500 mL种子培养基，于高压灭菌锅121 ℃灭菌15 min，分装至500 mL具塞透明玻璃瓶，接入菌种，置于人工气候箱培养6 d得到500 mL对数期种子菌液。

同菌液扩大培养方法，配制发酵培养基4 750 mL，按5%的接种量接入上述对数期种子菌液，于实验室人工气候箱培养7 d即获得5 000 mL扩大菌液。

1.3.2 类球红细菌番茄红素的提取工艺

吸取25 mL扩大菌液于50 mL离心管，6 000 r/min离心5 min，弃上清液得到约0.2 g湿菌体，生理盐水水洗涤2次。加入5 mL预处理液处理30 min后，6 000 r/min离心3 min，弃上清液，所得菌泥加入有机溶剂进行避光超声提取，破碎频率为破碎5 s间隔5 s，破碎提取10 min。超声提取后6 000 r/min离心1 min，所得上清液即为番茄红素提取液。0.45 μm微孔滤膜过滤后作为试样。

1.3.3 预处理液的选择

为了提高番茄红素的提取效率，减少提取过程中番茄红素的氧化损失，需对菌体进行预处理后再作提取[13,17]。按上述方法得到湿菌体后，分别加入5 mL 95%乙醇溶液、0.25 mol/L Na2CO3溶液、0.25 mol/L NaHCO3溶液、0.25 mol/L NaOH溶液预处理30 min后，6 000 r/min离心1 min弃上清液，菌泥加20 mL丙酮（料液比为1∶100（g/mL）），混匀，避光超声提取10 min，提取1 次。离心收集上清液，丙酮定容至50 mL，测定最大吸收波长处的吸光度，将吸光度最大者确定为最佳预处理液。

1.3.4 最佳溶剂的选择

按上述方法对原料进行预处理后，分别加入20 mL丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、氯仿（料液比为1∶100（g/mL））[18-21]，在室温条件下避光超声提取10 min，提取1 次。用紫外-可见分光光度计测定不同提取液最大吸收波长处的吸光度，将吸光度最大者确定为最佳提取溶剂。

1.3.5 番茄红素测定波长的确定及标准曲线的测定

精密称取1.00 mg番茄红素标准品，丙酮溶解，定容至10 mL，得100 μg/mL储备液。吸取0.5 mL储备液于1 cm厚比色杯中，在紫外-可见分光光度计上进行波长扫描（200～800 nm），得知番茄红素丙酮溶液在446、471、502 nm波长处均有特征吸收峰，因多种类胡萝卜素在471 nm波长处吸收较强，在502 nm波长处吸收较小[22]。为减少其他类胡萝卜素对番茄红素测定的干扰，本研究选取502 nm为类球红细菌番茄红素的检测波长。

精密吸取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL储备液于10 mL容量瓶，用丙酮稀释至刻度，获得5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/mL的标准品溶液，测定其在波长502 nm处的吸光度A。以标准品吸光度对标准品质量浓度ρ（μg/mL）作线性回归。

1.3.6 番茄红素提取量的计算

对所得提取液稀释一定倍数后，利用紫外-可见光分光光度计测定吸光度，从标准曲线可获得供试品质量浓度。

式中:ρ为供试品质量浓度/（μg/mL）；V为提取液体积/mL；f为稀释倍数；M为菌体湿质量/g。

1.3.7 单因素试验设计

采用丙酮作为提取溶剂，选择皂化时间、料液比、超声时间、提取次数这4 个对类球红细菌番茄红素提取效果有影响的工艺参数进行单因素试验。各因素的水平梯度设置分别为皂化时间20、30、40、50、60 min，料液比1∶50、1∶75、1∶100、1∶125、1∶150（g/mL），超声时间5、10、15、20、30 min，提取次数1、2、3、4次。不同条件下提取番茄红素后，按照1.3.6节方法计算该方法条件下的番茄红素提取量。

1.3.8 响应面试验设计

以单因素试验为基础，根据Box-Behnken试验设计的原理，利用Minitab 16软件设计Box-Behnken响应面试验，对提取工艺进行优化试验设计并进行数据处理，试验结果用二次多项式回归拟合，用微分计算预测最佳提取工艺。选取皂化时间、料液比、超声时间、提取次数4 个主要影响因素为自变量，以番茄红素提取量为响应值。

2 结果与分析

2.1 预处理液的选择

从图1可以看出，在皂化30 min、料液比1∶100（g/mL）、超声破碎10 min、提取1 次的条件下，NaHCO3溶液对类球红细菌的预处理效果最好。这是由于皂化作用及乙醇处理可以破坏类球红细菌的细胞壁和组织结构，有利于番茄红素的溶出；另一方面，一些不溶于水的脂类、脂肪酸等物质会溶于醇或在碱的作用下溶于水而被离心除去，这有利于提取溶剂对番茄红素的提取。但番茄红素会溶于乙醇且对碱不稳定，pH值过高可能会破坏番茄红素的结构，因此95%乙醇溶液、NaOH溶液或Na2CO3溶液作为预处理液时色素的提取量均较低，因此选NaHCO3溶液作为预处理液。

2.2 最佳提取溶剂的选择

从表1可以看出，在皂化30 min、料液比1∶100（g/mL）、超声破碎10 min、提取1 次的条件下，番茄红素在不同有机溶剂中的最大吸收波长及其吸光度不同，其中丙酮的吸光度最大，提取效果最好。因此本实验确定丙酮为类球红细菌番茄红素的最佳提取溶剂。

2.3 标准曲线的测定

按1.3.5节方法制得番茄红素的标准曲线，得A=0.040 0ρ-0.027 6，R2=0.999 9（n=5）。结果表明:番茄红素在5.00～25.00 μg/mL质量浓度范围内线性良好。

2.4 单因素试验结果

2.4.1 皂化时间对提取效果的影响

采用NaHCO3溶液皂化一定时间后，离心收集菌泥，按料液比为1∶100（g/mL）加入丙酮，超声10 min，提取1次，考察皂化时间对类球红细菌番茄红素提取效果的影响。

从图2可以看出，在皂化时间小于30 min时，番茄红素提取量随着时间的延长而增大，这是因为皂化过程可以在一定程度上破碎细胞以及去杂质，当皂化充分后，由于番茄红素的不稳定性，继续皂化可能将导致番茄红素发生结构上的破坏，故在30 min后，随着皂化时间延长，番茄红素提取量呈下降趋势。因此选取皂化时间为30 min。

2.4.2 料液比对提取效果的影响

采用NaHCO3溶液皂化30 min后，离心收集菌泥，按不同料液比（g/mL）加入丙酮，超声10 min，提取1 次，考察料液比对类球红细菌番茄红素提取效果的影响。

由图3可以看出，当料液比从1∶50降低到1∶75时，提取量随之提高，这是因为溶剂用量越大，越有利于番茄红素在溶剂中的有效溶解。但当继续降低料液比时，由于番茄红素的提取渐达平衡，故提取量亦趋稳定。综合考虑经济成本及提取效果，选取料液比1∶75（g/mL）为宜。

2.4.3 超声时间对提取效果的影响

采用NaHCO3溶液预处理30 min后，离心收集菌泥，按料液比为1∶75（g/mL）加入丙酮，超声提取1 次，考察超声时间对类球红细菌番茄红素提取效果的影响。

从图4可知，在5～10 min内，类球红细菌中番茄红素提取量随着超声时间的延长而增加。这是因为超声不但提高了细菌的破碎效果，而且促进番茄红素与有机溶剂的接触，故随着超声时间的延长番茄红素提取量也随着增加。但当继续延长超声时间时，由于细菌已完全破碎，提取也趋平衡，延长超声时间反而会由于番茄红素的不稳定性而降低番茄红素的提取量。故超声10 min为宜。

2.4.4 提取次数的选择

采用NaHCO3溶液预处理30 min后，离心收集菌泥，按料液比为1∶75（g/mL）加入丙酮，超声提取10 min，考察提取次数对类球红细菌番茄红素提取效果的影响。

从图5可见，经过第2次提取后，大部分番茄红素已被提取，当再增加提取次数时，番茄红素提取量很低，这说明类球红细菌中番茄红素已几近提取完全，综合考虑经济成本及提取效果，提取2 次为宜。

2.5 响应面试验结果

2.5.1 响应面试验设计与结果

结合单因素试验结果，以提取量为响应值，对皂化时间（X1）、料液比（X2）、超声时间（X3）、提取次数（X4）4 个因素与番茄红素提取量进行Box-Behnken四因素三水平响应面分析试验，响应面分析方案与试验结果见表2。

2.5.2 模拟方程的建立及显著性检验

应用Minitab 16软件对表2中的数据进行多元回归拟合，可得出4 个因素和提取量之间的二次多项回归模型:

Y=9 146.63-135.55X1+491.20X2+520.32X3+ 737.93X4-943.89X12-801.17X22-1462.08X32-820.48X42-144.94X1X2+104.94X1X3-410.47X1X4+ 382.97X2X3+160.44X2X4-14.50X3X4

对所得回归模型进行显著性检验，结果见表3。从表中可知:回归项P＜0.001表明回归模型极显著，失拟项P=0.178＞0.05，表明回归模型失拟不显著，说明模型拟合度良好。同时可得知，4个因素的线形、平方、交互作用对提取量的影响都极显著。方程的相关系数表明模型回归方程的拟合程度良好，可用来分析和预测类球红细菌番茄红素的提取工艺。

对所得回归模型系数进行显著性检验，结果见表4。结果显示:模型的X1X2、X1X3、X2X4、X3X4项不显著，其余项均极显著，说明这4 个因素对类球红细菌番茄红素提取量的影响不是简单的线性关系。

2.5.3 响应面分析与工艺优化

根据回归方程绘出响应面图及等高线图，以确定各因素对番茄红素提取效果的影响，响应面图和等高线图见图6。等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，椭圆越明显则两因素间交互作用越显著。从图6可以看出，皂化时间与提取次数及料液比与超声时间的相互作用较显著。

利用Minitab软件进行试验结果优化得到最佳工艺条件。分别得到X1（皂化时间）=27.878 8 min、X2（料液比）=1∶85.858 6（g/mL）、X3（超声时间）= 11.161 6 min、X4（提取次数）=2.535 4，预测提取量为9 525.92 μg/g。为检验该最佳提取工艺的可靠性，采用上述响应面优化结果进行番茄红素提取的验证实验，考虑到实际操作可行性，将工艺条件改进为皂化时间28 min、料液比1∶86（g/mL）、超声时间11 min、提取次数2 次，提取番茄红素提取量为9 326.48 μg/g，与理论值的相对误差较小，因此该类球红细菌番茄红素提取方法是有效可行的，具有实际应用价值。

3 结 论

目前，番茄红素相关产品的研究开发已成为国际功能性食品和新药研究中的一个热点，在国外已有以番茄红素为主要成分的针剂类等药物100多种[23]。可以预计，未来几年对番茄红素产品的需求会越来越大，而具有经济、高效等特点的微生物发酵生产法恰好解决了这一难题[24-25]，因而建立相应的方便快捷的、准确的番茄红素提取方法是非常有意义的。

本研究分别用单因素试验和响应面法对类球红细菌番茄红素的提取工艺进行了优化。单因素试验结果显示，丙酮为类球红细菌番茄红素提取的最佳有机溶剂，NaHCO3溶液为最佳皂化液，皂化时间30 min、料液比1∶75（g/mL）、超声时间10 min、提取次数2 次为最佳提取条件。在此基础上，采用Box-Behnken试验设计及响应面法分析，对类球红细菌番茄红素提取工艺进行了优化，得到了各因素对提取量影响的二次回归模型。经优化得到番茄红素提取工艺为:皂化时间27.878 8 min、料液比1∶85.858 6（g/mL）、超声时间11.161 6 min、提取次数2.535 4。考虑到实际操作的可行性，最后优化的提取工艺为:皂化时间28 min、料液比1∶86（g/mL）、超声时间11 min、提取次数2 次。经实验验证，该提取方法切实可行。因此，利用响应面法对类球红细菌番茄红素提取方法进行优化，可获得最佳工艺参数，能够为进一步实验研究提供理论依据。

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Optimization of Extraction Process for Lycopene from Rhodobacter sphaeroides by Response Surface Methodology

LI Dehe, WANG Junwei, ZHAO Yue*
(College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

This study aimed to optimize the extraction of lycopene from Rhodobacter sphaeroides by response surface methodology. With the extraction yield of lycopene per gram of cells as the response value, based on single factor experiments, response surface methodology was used to explore the effects of saponifi cation time, liquid-to-material ratio, ultrasonic treatment time and extraction number as well as their interactions on the extraction rate of lycopene. As a result, a regression model was established and the optimal extraction parameters were determined as 28 min saponifi cation, 11 min ultrasonic treatment and extraction performed twice using acetone as the extraction solvent with a material-to-liquid ratio of 1:86 (g/mL). Under these extraction conditions, the extraction yield of lycopene was 9 326.48 μg/g. The extraction method developed in this study is feasible and will lay a foundation for further study of industrial production of lycopene by R. sphaeroides fermentation.

Rhodobacter sphaeroides; lycopene; extraction; response surface methodology

TS201.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201510004

2014-09-30

国家自然科学基金面上项目(81374072)

李德和(1990—),男,硕士研究生,研究方向为中药微生物代谢。E-mail：lear19900811@gmail.com

*通信作者：赵越(1955—),女,教授,学士,研究方向为中药新剂型开发与研究。E-mail：zybmbylk688@163.com