2014版液相色谱仪检定规程的探讨

2015-04-06上海市计量测试技术研究院

上海计量测试 2015年1期

李硕　邱旸　张敏 / 上海市计量测试技术研究院

2014版液相色谱仪检定规程的探讨

李硕邱旸张敏 / 上海市计量测试技术研究院

0　引言

在化学分析领域，液相色谱仪可谓应用最为广泛的几种大型设备之一。在色谱类分析仪器中，其更是发挥着不可替代的重要作用，用于食品，医药，生物，环境监测，石油化工等领域。2014年8月14日，我国开始实施新版JJG 705-2014《液相色谱仪检定规程》（以下简称新版检定规程）。相比于2002版检定规程，新版检定规程描述更加准确合理，对于实际操作具有更强的指导作用。然而，检定人员在日常工作中依然会遇到一些问题，现结合笔者一些经验，对检定规程提出一些建议与同行共同探讨。

1　液相色谱仪输液系统的检定

在新版检定规程中［1］，关于输液系统的检定项目包括：泵耐压、泵流量设定值误差、泵流量稳定性和梯度误差。但没有针对泵压力的稳定性制定相关检定方法及标准。其实，液相色谱系统的压力是否稳定，是评价该仪器性能的一个重要参数。如果压力波动较大，对仪器的流量稳定性、定量及定性重复性都会产生影响。造成泵压力波动的因素有很多，有一些是人为的，是由于流动相在使用前气泡未脱净，或者由于流动相在使用前未抽滤而导致杂质过多等。这些因素需要在检定工作开始前排除。更主要的是泵长期使用，性能下降所导致的：如单向阀中宝石球产生的磨损；密封垫的老化；含缓冲盐的流动相而导致盐分在泵上析出附着以及对泵的腐蚀等。因此泵压力的稳定性，能直观反映出泵在使用过程中性能的优劣。各大仪器厂家所开发的操作系统中，也均具有监控仪器实时压力的功能，可以读出泵的实时压力变化，以保证用户能够及时发现压力系统的异常情况。因此建议，可以参考温度稳定性的评价方法，记录一定时间内泵压力实时变化情况，并计算该时间内的压力稳定性，从而更加全面地评价液相色谱仪在使用中泵性能的变化。

2　超高压液相色谱的检定

超高压液相色谱仪由于其分析速度快、灵敏度高等优点，近年来应用日益广泛，尤其在液相色谱-质谱联用仪中，用户多选择超高压液相色谱仪。国外知名的仪器生产厂商，例如安捷伦、沃特斯和岛津公司都推出了自己的超高压液相设备。但新版检定规程中，未根据超高压液相色谱仪的特殊性而设置具有针对性的检定条件。按照新版检定规程中规定的方法，在进行定量重复性和最低检测浓度检定时，流速应设为1.0 mL/min，这对于常规液相色谱仪是普遍适用的。但超高压液相色谱仪通常需要配备超高压液相色谱柱，并非常规的色谱柱。由于超高压液相色谱柱的粒径普遍较小，通常小于2 μm（常规液相色谱柱一般为5～10 μm）。因此在使用中为防止仪器压力过高而导致损害输液泵等配件，往往需要对流速进行严格控制，一般应在0.1～0.5 mL/min范围内。如采用新版检定规程中规定的流速，将使整个系统压力过高，无法正常工作。为安全起见，同时结合实际操作中积累的经验，建议应采用较低流速，一般采用0.2 mL/min或0.3 mL/min即可。当然，如果使用常规色谱柱替代超高压色谱柱，也是可以在流速1.0 mL/min的标准条件下进行检定工作的。但由于常规色谱柱的柱效明显低于超高压液相色谱柱，对于同等浓度的样品，采用常规色谱柱产生的色谱峰峰高明显低于超高压液相色谱柱产生的峰高，导致最低检测浓度的计算结果无法真正反映出超高压液相色谱仪灵敏度高这一优点，从而影响对仪器真实性能的评价。正因为超高压液相色谱具有更高的灵敏度（即更低的最低检测浓度），因此也应针对其这一特点制定不同于常规液相的合格判定标准。随着超高压液相色谱的推广，制定规程时应考虑到超高压液相系统的特殊性，在规程中设定针对超高压液相色谱检定的色谱条件以及合格判定标准。

另外，进行超高压液相色谱仪的检定工作时，要特别注意进样量的选择。常规液相色谱仪检定时，由于其自动进样器能准确控制进样量的范围为0.1～100 μL，因此可选择的范围较广，将进样量设置为10 μL或20 μL，甚至更高的进样量都没有问题。但很多超高压液相色谱仪由于其自动进样器默认配备的定量环定量体积较小，其能精确控制的进样量一般≤7.5 μL。如果仍较高地进样会导致自动进样器无法准确定量，这将会严重影响仪器定量重复性的测定结果。这种情况下，需要将进样量调整为1～5 μL，才能保证得到正确的测量结果。

3　自动进样器缺少相关检定方法及标准

随着液相色谱仪自动化程度的日益提高，大多数液相色谱仪都配制了自动进样器。自动进样器作为液相色谱仪的重要组成部分，由于直接影响进样量的准确性，因此其计量性能的优劣对整套设备的定量准确性影响很大。在美国FDA及欧盟的质量体系认证中，该项目都是必须认证的项目。而我国新版检定规程中缺少针对该项目的检定方法及标准。国家也未颁布有关自动进样器的校准规范。在实际工作中没有可以依据的标准来开展该项目的计量工作，无法实现与国际接轨。因此有必要在检定规程中增加该项目的检定方法或制定相关校准规范用以指导计量工作的开展。由于并非所有仪器都配制自动进样器，因此可列为非必检项目。中国食品药品检定研究所的王冠杰［2］等已经针对该项目的校准方法开展了实验，参照欧洲医药管理局（OMCL）在《质量控制文件》［3］中提供的校准方法，对自动进样器的进样准确性、重复性和进样残留项目进行系统的研究，建立了相关的实验方法并对校准方法的测量不确定度进行评价。该研究具有很强的借鉴价值，但所涉及的仪器型号较少，如能有更多型号的仪器进行验证，将为日后该项目检定校准方法的建立奠定基础。

4　缺乏正相色谱系统检定方法及标准物质

正相色谱的应用范围虽不如反相色谱广泛，但其在食品、医药等领域也发挥着不可替代的作用。新版检定规程中，仅给出了反相色谱条件下开展检定的方法。但在实际检定工作中会遇到很多采用正相色谱系统的液相色谱仪。因此会遇到两方面的问题：（1）如果严格按照新版检定规程的方法，需先将正相色谱条件切换至反相条件，即将正相流动相（如正己烷），经异丙醇置换完全后，再用反相流动相（如甲醇）置换完全。整个切换过程比较繁琐，每一步的置换过程都需要经过较长时间的平衡，才能保证管路中残留的流动相被置换完全，此举大大增加了检定工作的时间，而且有些客户的仪器在日常工作中，只用正相色谱系统进行特定样品的分析工作；（2）从客户的角度讲，他们并不希望进行正反相系统的切换，因为在切换过程中如果操作不当（如流动相置换不充分），会对整个机器的稳定性造成影响，导致样品保留时间产生偏差等。如果在正相条件下进行检定，又由于缺乏相关标准物质和检定方法，导致检定工作无法正常开展。基于以上原因，应针对不同检测器，研制一系列用于检定正相色谱系统的标准物质。这样可以避免繁琐的流动相切换，提高工作效率，也可为客户提供便利，更容易为客户所接受。

5　线性范围的检定

在液相色谱仪的实际应用中，许多用户需要建立线性曲线用于样品含量的检测。仪器线性的好坏，直接关系到定量是否准确，是关乎仪器质量的一项重要指标。检定规程也对“线性范围”的检定制定了相关方法，但新版检定规程中仅将其作为检测器性能判定的标准。虽然新版检定规程中的方法能反映出检测器线性响应的优劣，但仪器的线性性能，不但受检测器的影响，进样器的进样准确性、温度的波动、色谱柱的性能等也会对其产生影响。因此应将液相色谱仪线性范围的评价，作为整机性能考察中的一项评判标准，而不单单是只作为评价检测器性能的标准。在检定规程中，针对不同检测器规定了相关的标准物质（紫外-可见光检测器，二极管阵列检测器和荧光检测器为萘-甲醇标准溶液；示差折光率检测器和蒸发光散射检测器为甲醇中胆固醇标准溶液）。可以将检定方法由直接向检测器中注入的方式变更为通过进样系统依次进同体积不同浓度标准溶液的方式。样品通过整个系统后，将软件中记录下的色谱图经积分处理后，用得到的响应值（峰高或峰面积）对相应浓度作标准曲线来进行线性范围的检定。这样既可以考察检测器线性响应能力的优劣，也可以兼顾进样器的进样准确性等其他因素的影响，因此可以对整套设备的线性水平做出评价。

另外，在考察仪器线性水平时，除了线性范围这一指标外，还应增加线性相关性（即相关因子r）这一指标的考察。因为该参数更能直观反映仪器线性响应性能的优劣。而用户在实际应用中，也常常需要利用外标法绘制标准曲线，其绘制的标准曲线的线性相关程度是有要求的（一般r≥0.999 5）。如果仪器本身的线性相关性较差，会导致用户在利用外标法进行含量计算时产生较大偏差，或无法绘制出符合线性要求的线性曲线。线性相关性的检定方法可参照线性范围的检定方法同步进行。新版检定规程中规定，进行线性范围检定时，首先依据前五个浓度点的响应值绘制标准曲线，并作为判断后续浓度点是否为检测上限的依据。因此在建立标准曲线的同时，可以同步计算出该标准曲线的相关因子r。如果相关因子合乎标准，表明仪器线性相关性合格，再进行线性范围的后续计算。如果相关因子不合格，则表明仪器的线性相关性出现了问题。