颜小飞，黄粮，严莲花，胡芬，王亚，马闻晗，卢帅，，汪朝晖( 华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉4300;武汉市第四医院)

扩张型心肌病患者外周血单个核细胞miR-155表达及意义

颜小飞1，黄粮2，严莲花1，胡芬1，王亚1，马闻晗1，卢帅1，2，汪朝晖1
( 1华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉430022;2武汉市第四医院)

摘要:目的探讨微小RNA-155( miR-155)在扩张型心肌病( DCM)患者外周血单个核细胞( PBMC)中的表达变化及其与心功能的关系。方法选择DCM患者(观察组)及同期健康志愿者(对照组)各30例，观察组NYHA心功能Ⅱ级10例、Ⅲ级11例、Ⅳ级9例。采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离两组空腹静脉血中的PBMC，实时荧光定量PCR法检测PBMC中miR-155的相对表达量。比较观察组不同NYHA心功能分级者PBMC中miR-155的相对表达量，并分析其相关性。观察组同时行彩色多普勒检查，记录其左心室射血分数( LVEF)、左心室舒张末期内径( LVEDd)，分析两者与miR-155表达的相关性。结果观察组miR-155相对表达量为0.50±0.24，对照组为1.00±0.23;两组比较，P＜0.01。观察组NYHA心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级者miR-155相对表达量分别为0.77±0.10、0.47±0.10、0.23±0.08，多组间及组内两两比较，P均＜0.01。观察组LVEF为28%±10%，LVEDd为( 70±7) mm。观察组miR-155相对表达量与NYHA心功能分级、LVEF、LVEDd均呈负相关( r分别为－0.94、－0.67、－0.53，P＜0.05或＜0.01)。结论DCM患者PBMC中miR-155表达降低，与患者心功能受损的严重程度有关。

关键词:扩张型心肌病;微小RNA-155;外周血单个核细胞;心功能

Expression changes and significance of miR-155 in peripheral blood mononuclear cells of patients with dilated cardiomyopathy

YAN Xiao-fei1，HUANG Liang，YAN Lian-hua，HU Fen，WANG Ya，MA Wen-han，LU Shuai，WHANG Zhao-hui
( 1 Union Hospital，Tongji Medicial College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China)

Abstract:Objective To observe the expression changes of microRNA-155 ( miR-155) in the peripheral blood mononuclear cells ( PBMC) of patients with dilated cardiomyopathy ( DCM) and to explore the relationship between miR-155 level and heart function.Methods Thirty patients with DCM ( observation group) and 30 healthy volunteers ( control group) were selected.In the observation group，10 cases were gradeⅡof NYHA functional classification，11 cases were gradeⅢand 9 cases were gradeⅣ.PBMC in the two groups were separated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation，and the relative expression of miR-155 was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.The miR-155 levels were compared between the observation group and the control group and among DCM patients with different NYHA functional classification.In the observation group，the left ventricular ejection fraction ( LVEF) and left ventricular end diastolic diameter ( LVEDd) were recorded by color Doppler ultrasound.The relationships between miR-155 levels and LVEF，LVEDd were analyzed in DCM patients.Results The relative expression levels of miR-155 in the observation group and control group were ( 0.50±0.24) and ( 1.00±0.23)，which showed a significant difference ( P＜0.01).The relative expression levels of miR-155 in NYHA functional classificationⅡ，Ⅲ，ⅣDCM patients were ( 0.77±0.10)，( 0.47± 0.10) and ( 0.23±0.08)，respectively.There were significant differences between each two groups ( all P＜0.01).In the observation group，the LVEF was 28%±10%，and the LVEDd was ( 70±7) mm.The miR-155 level was negatively

correlated with NYHA functional classification，LVEF and LVEDd in DCM patients ( r =－0.94，－0.67 and－0.53，P ＜0.05 or P＜0.01).Conclusions The expression level of miR-155 is down-regulated in PBMC of DCM patients and is correlated with the severity of impaired cardiac function.

Key words:dilated cardiomyopathy; microRNA-155; peripheral blood mononuclear cells; cardiac function

扩张型心肌病( DCM)是以左心室或双心室扩大和收缩功能受损为特征、细胞免疫和体液免疫共同参与的自身免疫性疾病［1］，其发病机制尚未完全阐明。微小RNA( microRNAs)是一类长19～25个核苷酸、不具备蛋白质编码功能的单链小分子RNA，它们通过与靶mRNA完全或不完全互补配对，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻译成蛋白质，从而调节基因表达［2］。microRNA-155 ( miR-155)在造血细胞的分化、炎症反应、免疫应答、肿瘤的发生等多种生物学过程中均发挥重要作用［3］，但其与DCM发生、发展相关性的报道较少。本研究观察了miR-155在DCM患者外周血单个核细胞( PBMC)中的表达情况，并探讨其与心功能的关系。

1　资料与方法

1.1临床资料选择2013年12月～2014年12月在华中科技大学同济医学院附属协和医院心血管内科住院的DCM患者30例(观察组)，其中男21例、女9例，年龄26～55( 41±12)岁; NYHA心功能Ⅱ级10例、Ⅲ级11例、Ⅳ级9例。均符合1995年WHO/ISFC制定的DCM诊断标准［4］，排除高血压、冠心病、心脏瓣膜病、肺心病、代谢性疾病患者。选取同期健康志愿者30例(对照组)，其中男20例、女10例，年龄23～58( 39±11)岁。两组性别、年龄均具有可比性。本研究获得华中科技大学同济医学院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 PBMC分离及miR-155表达检测采集两组空腹静脉血5 mL于EDTA-K2抗凝管中，1 h内采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC。TRIzol试剂从PBMC中提取总RNA，具体操作参见试剂盒说明书。紫外分光光度计测定RNA样品在波长260 nm和280 nm处的吸光度( A)值，A260/A280在1.8～2.0表示RNA纯度较好。逆转录合成cDNA，采用实时荧光定量PCR法检测miR-155相对表达量。miR-155、U6的逆转录和PCR引物均由广州锐博公司设计、合成。miR-155上游引物: 5'- GGAGGTTAATGCTAATCGTGATAG-3'，下游引物: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，扩增长度60 bp;以U6为内参，上游引物: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，扩增长度94 bp。PCR反应体系50 μL: 2 ×PCR Master Mix 25 μL，5 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，cDNA 5 μL，去离子水加至50 μL。PCR反应条件: 95℃10 s，95℃15 s，60℃60 s，循环40次。通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析，miR-155相对表达量用2－ΔΔCt表示。实验用淋巴细胞分离液购于美国GE公司，TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司，紫外分光光度计购于日本Shi madzu公司，Reverse Transcription System购于美国Promega公司，SYBR Green PCR Master Mix Kit、实时定量PCR仪购于美国Applied Biosystems公司。

1.3心功能检查观察组行彩色多普勒检查(彩色多普勒超声诊断仪，荷兰Philips公司)，记录左心室射血分数( LVEF)和左心室舒张末期内径( LVEDd)。

1.4统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，多组间比较采用秩和检验，两组间比较采用单因素方差分析。观察组PBMC中miR-155相对表达量与NYHA心功能分级及LVEF LVEDd的关系采用Spearman或Pearson相关分析P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组miR-155相对表达量比较观察组miR 155相对表达量为0.50±0.24，对照组为1.00± 0.23;两组比较，P＜0.01。

2.2观察组不同NYHA心功能分级者miR-155相对表达量比较观察组NYHA心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级者miR-155的相对表达量分别为0.77±0.10、0.47 ±0.10、0.23±0.08，多组间及组内两两比较，P均＜0.01。

2.3观察组miR-155相对表达量与心功能分级LVEF及LVEDd的关系观察组LVEF为28%± 10%，LVEDd为( 70±7) mm。Spearman相关分析显示，观察组miR-155相对表达量与NYHA心功能分级呈负相关( r =－0.94，P＜0.01) ; Pearson相关分析显示，观察组miR-155相对表达量与LVEF LVEDd均呈负相关( r分别为－0.67、－0.53，P均＜0.05)。

3　讨论

DCM是年轻人终末期心力衰竭和心脏移植的主要原因［5］，其发病机制至今尚未完全明确。研究

显示，部分病毒性心肌炎( VMC)可以演变为DCM［6，7］，故有学者认为VMC和DCM可能是同一疾病的两个不同阶段［8］。研究发现，DCM患者血清中存在多种抗心肌自身抗体［9］，以及辅助性T细胞( Th)和调节性T细胞失衡［1，10］，表明细胞免疫和体液免疫可能均参与了DCM的发病过程。

miR-155是一个典型的多功能microRNA，对巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞等多种炎症免疫细胞均具有调节作用，可影响天然免疫和获得性免疫过程，与多种免疫炎症性疾病的发生发展有关［11，12］。Satoh等［13］研究显示，DCM患者心肌组织miR-155表达明显低于左心室功能正常人群，提示miR-155可能负向调控DCM的发生、发展。本研究结果显示，观察组PBMC中miR-155表达降低，说明miR-155可能是DCM发生的一种保护性因子;而观察组NYHA心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级者miR-155表达依次降低，且miR-155表达与NYHA心功能分级、LVEF、LVEDd均呈显著负相关，以上均说明miR-155表达与DCM患者心功能受损的严重程度有关，可作为判断病情的指标之一。

O'Connell等［14］、Murugaiyan等［15］研究证实，自身免疫性脑脊髓炎( EAE)小鼠PBMC中miR-155表达上调、Th1/Th17比例升高，而miR-155敲除的EAE小鼠Th1/Th17比例明显降低。Yao等［16］研究发现，miR-155在急性冠脉综合征患者PBMC中表达明显降低，而Th17细胞比例却是升高的。以上说明在不同的病理状态下，miR-155对Th17有不同的调节作用。本研究样本量偏少，没有检测T、B淋巴细胞等免疫相关指标，因此对miR-155在DCM发病中的机制尚未明了，需要进一步的研究证实。

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·基础研究·

收稿日期:( 2015-06-11)

通信作者简介:汪朝晖( 1969-)，女，主任医师，研究方向为心血管病;曾获教育部科技进步二等奖1项和湖北省科技进步一等奖和二等奖各1项。E-mail: sgwangtjm@163.com

作者简介:第一颜小飞( 1979-)，男，主治医师，研究方向为心血管病。E-mail: yxfb329@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 81170205)。

文章编号:1002-266X( 2015) 32-0020-03

文献标志码:A

中图分类号:R542.21

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.32.007