龙丽坤+李飞武+李葱葱+武奉慈+宋新元

摘要：应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量检测转基因玉米MON89034×NK603的3个复合性状转基因玉米中CryA05、Cry2Ab2、C4-ESS蛋白在各组织中的表达量，分别取苗期和心叶期叶片、吐丝期花粉和花丝、灌浆期籽粒、雌穗顶端和茎髓组织进行检测。结果显示，3个转基因品种中，外源基因在各组织中的表达显示较高的一致性，均在叶片组织表达最高。转化体同一组织中表达外源蛋白在品种间变异不明显，组织间差异大于品种差异。

关键词：复合性状转基因玉米；ELISA；外源蛋白；时空表达规律

中图分类号： S53035文献标志码： A

文章编号：002-302（204）2-0029-05

自998年首例转基因玉米被批准商业化以来，转基因玉米种植面积不断扩大，随着转基因技术快速发展，新一代转基因植物及复合性状转基因植物不断涌现。20年，全球共有6个国家种植转基因玉米，种植面积达到5 00万hm2，占全球玉米种植总面积的32%。抗虫耐除草剂复合性状转基因玉米种植面积近2年来不断增长，202年种植面积达 2 029万hm2，比20年增长09%。复合性状转基因玉米已逐渐取代了单一性状转基因玉米，成为市场主导[2]。然而，转基因大面积种植后引起的生态环境安全等问题也引起了人们的广泛关注[3-4]。因此，对复合性状转基因玉米在不同栽培条件下外源蛋白时空表达成为转基因环境安全评价的关注焦点之一[5]。本试验材料为孟山都公司选育的DK007YGRR、DK008YGRR、NC6304YGRR等3个复合性状转基因玉米品种，这3个品种均以MON89034和NK603为亲本杂交选育而成，具有来自父本的CryA05和Cry2Ab2杀虫蛋白基因和母本的C4-ESS蛋白外源基因，表达双价抗虫和耐除草剂的复合性状。本研究采用ELISA方法对3个复合性状转基因玉米不同时期、不同组织进行外源蛋白表达的实时检测，研究复合性状转基因玉米抗虫和耐除草剂基因的时空表达规律。同时，以本品种的同型对照品种以及当地主栽品种作为阴性对照开展外源蛋白组织表达测定，以期阐明杂交种外源蛋白时空表达规律，为杂交选育复合性状转基因玉米环境安全评价方案提供参考依据。

材料与方法

材料和试剂

阳性转基因玉米材料3个，品种名为DK007YGRR、DK008YGRR、NC6304YGRR，同型对照阴性玉米样品分别为DK007、DK008和NC6304，由美国孟山都公司提供。当地主栽品种对照ZD958和C69为当地大田推广材料，购于种子公司。3个转基因玉米材料均为MON89034（双价抗虫）和NK603（耐除草剂）杂交选育的复合性状品种。

主要化学试剂采购于Sigma公司。

2田间试验设计和取样方法

2小区设计

NC6304YGRR和其同型对照NC6304、主栽品种对照ZD958种植于吉林省公主岭市；DK007YGRR、DK008YGRR，同型对照DK007、DK008，主栽品种C69种植于广西；每小区面积为30 m2（6 m×5 m），3次重复，随机区组排列。

22播种时间与方法

吉林省202年5月2日播种，常规播种方式，播种后按当地常规耕作管理模式进行管理。广西壮族自治区202年4月20日播种，常规播种方式，播种后按当地常规耕作管理模式进行管理。

23取样方法

[3]分抽雄前、抽丝、灌浆初期和乳熟末期4个时期取样，取样部位：苗期叶片、心叶期叶片、花粉与花丝、籽粒、雌穗顶端和茎髓，取样后用液氮速冻，-80 ℃低温冰柜保存。

3ELISA试验方法

3样品处理和蛋白抽提

当在田间对测试材料的各个组织进行采样后，当天放入实验室-80 ℃低温冰箱中进行保存，直至全部样品采集完毕，开始样品处理。样品组织在处理时先粉碎成均匀的粉末样本。样品称重后，对CryA05、Cry2Ab2、C4-ESS蛋白用×BST进行提取。提取的蛋白样品在6 h内进行测试时，保存在 4 ℃ 条件下，否则用小管分装保存在-80 ℃条件下。

32C4-ESS蛋白检测方法

单克隆小鼠抗C4 ESS抗体用含50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3缓冲液和 05 mol/L NaCl的溶液稀释至20 g/mL，每孔加00 L稀释的抗体在96微孔板上固定，放入4 ℃冰箱孵育8 h以上。用× BST洗板3次，分别在各孔对应加入C4-ESS蛋白标准液、样本提取液、标准品和样品缓冲液00 L/孔，37 ℃下孵育 h。秸秆、叶片、花粉、花丝和根样品提取液使用× BST/0% BSA溶液稀释；籽粒样品使用× TBA稀释。× BST 洗板3次，每孔加入00 L过氧化物酶偶联的抗C4 ESS抗体，37 ℃孵育 h。用× BST洗板3次，向孔内加入00 L TMB，室温静置0 min，加入00 L 6 mol/L H3O4终止酶反应。C4-ESS蛋白水平定量通过绘制0456～4600 ng/mL的C4-ESS蛋白标准曲线用内插法确定。

33Cry2Ab2蛋白检测方法

小鼠抗Cry2Ab2的捕获抗体用包被缓冲液（92 μL单克隆抗体加到0 mL 50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3的缓冲液）稀释，最终浓度为2 μg/mL，每孔加00 μL稀释抗体在96微孔板上固定，放入4 ℃冰箱孵育 8 h 以上。用×BST洗板3次，分别在各孔对应加入 00 μL Cry2Ab2蛋白标准液、样品提取液、标准品和样品缓[2]冲液（00 μL/孔），37 ℃孵育 h。×BST洗板3次，每孔加入00 μL生物素偶联的山羊抗Cry2Ab2抗体和NeutrAvidin-HR（ierce）来检测捕获的Cry2Ab2。× BST洗板3次，每孔加入00 μL TMB显色。向各孔中加入00 μL 6 mol/L H3O4终止酶活反应。通过绘制浓度为029～7000 ng/mL的Cry2Ab2蛋白标准曲线，用内插法完成定量。

34CryA05蛋白检测方法[2]

山羊抗CryA05的捕获抗体用包被缓冲液（50 mmol/L Na2CO3/NaHCO350 mmol/L NaCl）稀释至终浓度3 μg/mL，每孔加00 μL稀释抗体在96孔微孔板上固定，放入4 ℃冰箱中孵育8 h以上。用×BST洗板3次。进行籽粒样本分析时，向各孔加00 μL含9%脱脂奶粉（NFDM）的×BST，再进行封闭，37 ℃孵育 30～90 min，用×BST洗板3次，其他组织样本不进行此步骤。分别在各孔对应加入00 μL CryA05蛋白标准液或样品提取液，37 ℃孵育 h。用×BST洗板3次，每孔加入 00 μL 生物素偶联的山羊抗CryA05抗体和NeutrAvidin-HR（ierce）来检测捕获的CryA05。用×BST洗板3次，每孔加入00 μL HR底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）显色。向各孔中加入00 μL 6 mol/L H3O4终止酶活反应。通过绘制0438～4000 ng/mL CryA05蛋白标准曲线，用内插法完成定量。

4数据统计和分析

ELISA研究中采用Bio-rad iMarkTM 微孔板吸收光酶标仪进行检测。CryA05、Cry2Ab2、C4 ESS蛋白用波长450 nm时的吸光度和波长655 nm时的参考吸光度来确定其在样品中的表达量，在计算时根据标准蛋白所建立的标准曲线和内插法。蛋白的标准浓度用四参数逻辑曲线模型确定曲线，用内插法确定CryA05、Cry2Ab2、C4 ESS蛋白在各样品中的含量，并将结果由ng/mL转化为μg/g（鲜质量）。数据用ELISA软件进行归纳分析。

2结果与分析

2组织中外源蛋白表达的差异显著性分析

本试验的3个复合性状品种分别在吉林省和广西壮族自治区两地栽种，3个复合性状转化体，均为MON89034和NK603的杂交选育品种。3个转基因玉米材料的遗传背景的外源基因具有来自父本MON89034的双价抗虫基因（[WTBX][STBX]CryA05、Cry2Ab2[WTBZ][STBZ]）和来自母本的NK603耐除草剂基因（[WTBX][STBX]C4-ESS[WTBZ][STBZ]）。采样时期分别为苗期（V4）、心叶期（V8）、吐丝期（R）和灌浆期（R3），各时期采集的组织为V4 叶片、V8叶片、R花粉和花丝，R3籽粒、穗尖（雌穗顶端）、茎髓（雌穗着生节茎秆），在各小区中对每个组织材料随机选取5株进行蛋白提取。

对3个平行小区开展3次重复ELISA检测，根据405 nm吸光度的数值在标准曲线中对照其蛋白在转基因玉米植株中的外源蛋白表达含量。

表统计分析了3个复合性状转基因品种的 C4-ESS 蛋白在7个不同生长时期的组织中的表达情况，结果表明，同一组织内的蛋白表达在品种间多差异不显著，特别是叶片组织，V4叶片（新鲜）和V8叶片（新鲜）的 C4-ESS 蛋白持续稳定地高表达，均约为35 μg/g，其他组织在品种间或有差异，但各组织间表现了更大的差异显著性，方差分析结果见表2。

表3分析了3个复合性状转基因品种的CryA05抗虫蛋白在7个不同生长时期组织中的表达，该抗虫蛋白在各组织中表达差异较大。统计分析结果表明，3个品种同一组织蛋白表达量不同， 但差异均不显著，而组织间V4叶片、V8叶[FL）]

可见，复合性状的转化体组织表达外源蛋白在转化个体间变异不明显，其表达量与表达蛋白种类有关。组织间的差异大于品种差异，栽培种植条件也是影响其蛋白表达的原因之一。

22抗虫和耐除草剂基因在转化体中的蛋白表达

由图、图2、图3可见，转基因植株中耐除草剂蛋白 C4-ESS 在V4叶片、V8叶片、花粉、茎髓、穗尖、籽粒中表达量均高于CryA05、Cry2Ab2抗虫蛋白，只有在花丝中3种蛋白表达量均较低的情况下，Cry2Ab2蛋白表达量略高于C4-ESS。

CryA4、Cry2Ab2 2种抗虫蛋白的表达量在3个品种中表现趋势也较明显，CryA05抗虫蛋白在V4叶片、V8叶片、花粉、穗尖组织中的表达量高于Cry2Ab2抗虫蛋白；仅在3个品种的花丝、广西品种DK007YGRR和DK008YGRR茎髓和籽粒中，Cry2Ab2表达的抗虫蛋白量略高于CryA05。

因此，3个品种显示的耐除草剂和抗虫蛋白的组织表达规律一致，其外源蛋白的表达量可能与在其亲本来源有关，在亲本中的基因插入位置和表达调控可直接影响到其在杂交品种中的表达。

23植物各组织中外源蛋白的鲜质量含量

如图4、图5、图6所示，3个复合性状品种DK007YGRR、DK008YGRR、NC6304YGRR在各组织中表达情况也显示出较高的一致性，即营养器官组织（V4叶片、V8叶片）的外源蛋白表达量均高于生殖器官（花丝、花粉、穗尖、籽粒、茎髓）。V4叶片中3种外源蛋白表达最高，V8叶片其次，这一结果可能与叶片中可溶性蛋白含量较高有关。[2]

在3个转化体中，NC6304YGRR各时期的植物组织器官中CryA05蛋白表达量最高，DK007YGRR其次，DK008YGRR中表达相对较低。

在植物的营养器官中，NC6304YGRR的Cry2Ab2蛋白表达量最高，而生殖生长阶段中NC6304YGRR生殖器官（花丝、花粉、穗尖、籽粒、茎髓）中Cry2Ab2蛋白表达量均低于DK008YGRR。

在苗期和心叶期，3种转化体叶片中C4-ESS蛋白表达量最高，其中V4叶片时期略大于V8叶片时期，这种情况可能与前期转化体筛选有关。这一时期叶片的高表达量为草甘膦喷施效果提供了有效保证。

24植物生长条件对转化体外源蛋白组织表达的影响

NC6304YGRR是在吉林种植和栽培管理的玉米品种，DK007YGRR、 DK008YGRR在广西栽培种， 因此植株生长的

环境条件有所不同。生长在吉林的NC6304YGRR 的CryA05蛋白表达量基本均大于生长于广西的DK007YGRR、DK008YGRR。Cry2Ab2蛋白和C4-ESS蛋白表达量两地各不相同，无明显规律。复合性状转基因品种各组织中的外源蛋白表达量存在差异，且在相同条件栽种的DK007YGRR、DK008YGRR蛋白表达量同样存在差异，但差异较小。

3结论与讨论

转基因植株外源基因蛋白在不同生育期不同组织器官表达不同[6]，既可能与外界栽培条件有关，也可能与外源基因整合的位点有关[7]。当外源基因整合到与生长发育有关的基因附近，外源基因的表达就会受生长发育基因调控序列的调控，随着生长时期的不同而发生变化。

本研究结果表明，在转基因玉米各生长时期中，抗虫Bt蛋白含量均未明显减少，其抗虫的表达量趋于稳定，能够持续地进行抗虫表达，因此能够达到更好的抗虫效果。在玉米不同生长发育阶段的组织中，苗期叶片转基因蛋白表达量明显高于心叶期叶片。这可能与表达不同时期的环境条件有关，也可能与发育阶段中基因的表达调控相互关联。

在苗期和心叶期，3种转化体中，叶片C4-ESS蛋白表达量最高，其中V4叶片时期略大于V8叶片时期，这种情况可能与前期转化体筛选有关。这一时期叶片的高表达量为草甘膦喷施效果提供了有效保证。3个复合性状品种的 C4-ESS [2]蛋白均来源于转基因玉米品种NK603，因此笔者认为，通过杂交育种的复合性状转基因转化体对其亲本的安全评价可作为复合性状杂交种的安全评价的数据参考，其外源基因表达可能直接决定亲本多种杂交后代中外源基因的表达。

由于NC6304YGRR是在吉林种植和栽培的管理玉米材料，DK007YGRR、DK008YGRR在广西栽种，因此植株生长的环境条件有所不同，组织间外源蛋白表达呈现差异。这与文献中所述转基因植物外源基因表达与生长自然环境条件、栽培管理措施密切相关的结论相一致。而在相同条件下栽种的DK007YGRR、DK008YGRR同样存在表达蛋白量的差异，但差异较小。因此，组织表达与蛋白种类相关性更强，即与转入的外源基因的本身构建及插入基因组位置有显著的相关性，该研究结果与其他作物的转基因外源蛋白表达调控影响的研究[8-9]相一致。有研究表明，杂交本身对于外源基因的表达存在影响[0]，复合性状玉米与其亲本的表达差异和调控，有待于进一步研究。

ELISA方法是直接检测转基因植物体内外源蛋白表达量的手段之一，具有快速、简单、低耗、结果客观、易判定等特点。本试验的Bt蛋白和C4-ESS蛋白最低检出量为05 ng/mL，灵敏度较高。每样品均作平行检测，并设立阴性和空白对照，提高了检测的准确性与可靠性。ELISA方法的检测也受到检测环境温度、湿度的影响，因此每次检测要在环境相同的条件下进行，并且每次均须同时作空白及标准曲线，以减小误差。穗尖、花丝及花粉的外源蛋白含量比其他部位的含量低，因为这些部分的可溶性蛋白本身含量就低，多为纤维素及其他物质[2]。外源蛋白含量用 g鲜质量中含量表示时，结果受样品本身含水量的影响较大，导致有一定的误差。

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