刘晓燕，陈 琰，陈 婧，肖 珑，童晶晶，关崇丹，严立龙

解放军第302医院 肝衰竭诊疗与研究中心诊断与研究，北京 100039

红细胞补体第一受体在乙型慢加急性肝衰竭患者外周血红细胞中的表达动态观察

刘晓燕，陈 琰，陈 婧，肖 珑，童晶晶，关崇丹，严立龙

解放军第302医院 肝衰竭诊疗与研究中心诊断与研究，北京 100039

目的 探讨补体第一受体(complement receptor 1，CR1)在乙型慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)患者外周血红细胞的动态表达变化及其与预后的关系。方法 入组2013年12月- 2014年6月我院收治的31例HBV-ACLF患者和我科工作人员15例健康对照者(healthy controls，HC)，应用流式细胞术检测入组人群外周血红细胞CR1(erythrocyte complement receptor 1，ECR1)的表达量；应用红细胞天然免疫黏附肿瘤细胞的测定方法检测ECR1分子黏附活性：以5个或以上红细胞黏附1个肿瘤细胞为一个结合单位计算黏附率。对HBV-ACLF患者进行为期8周的随访，根据临床疗效分为好转组和无效组，动态观察2组患者外周血红细胞CR1变化。结果 ECR1在健康组(62.30±13.22)的表达明显高于肝衰竭组(41.21±14.33)(t=3.33，P=0.021)；8周后慢加急性肝衰竭患者病情好转组(47.31±16.36)较无效组(38.99±10.52)表达高(t=1.95，P=0.049)。健康组黏附活性(66.33±16.79)较慢加急性肝衰竭组(45.55±15.04)高(t=5.01，P=0.000)，但8周后不同疗效组之间黏附活性无统计学差异。动态观察结果表明，好转组患者ECR1表达量及黏附活性呈上升趋势，而无效组呈下降趋势或无变化。结论 ECR1表达量及黏附活性与HBV-ACLF患者预后相关，表达增强及黏附活性升高者预后好，动态观察红细胞免疫功能具有重要临床意义。

红细胞补体第一受体；乙肝病毒；慢加急性肝衰竭

免疫系统功能紊乱是诸多疾病发生、发展的主要机制之一。而补体系统广泛参与机体抗微生物防御反应及免疫调节，也可介导免疫病理的损伤性反应，是体内具有重要生物学意义的效应系统和效应放大系统。补体C3b是整个反应的关键，补体系统被激活后可产生一系列具有重要生物活性的片段，这些活性片段通过与表达在不同细胞表面的特异性受体结合而发挥作用。而红细胞补体第一受体(erythrocyte complement receptor 1，ECR1)就是其中主要受体之一。在许多免疫损伤疾病中ECR1表达下调，而HBV感染所致慢性肝损伤尤其是慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-acuteon-chronic liver failure，HBV-ACLF)的发病机制与免疫损伤相关，我们考虑在HBV-ACLF患者中可能存在类似改变。因此，我们对健康人群及该类患者的ECR1表达量及黏附活性进行了动态观察，以探讨ECR1在HBV-ACLF患者外周血红细胞的动态表达变化及其与预后的关系。

对象和方法

1研究对象 选取2013年12月- 2014年6月在我院住院治疗的HBV-ACLF患者31例为观察组，我科工作人员15例为健康对照组。入组的HBVACLF患者需符合2012年《肝衰竭诊疗指南》中慢加急性肝衰竭诊断标准[1]；排除标准：1)合并感染；2)合并其他自身免疫性疾病。

2疗效判定与分组 所有HBV-ACLF患者入院后均接受包括核苷类似物抗病毒治疗在内的内科综合治疗，根据治疗8周后疗效情况分为好转组与无效组。疗效判定标准：症状体征好转，肝功能明显好转[谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及总胆红素(total bilirubin，TBIL)较原水平下降50%以上]，且无明显波动者为好转组，其余判定为无效或死亡。

3临床指标检测 所有入组人群均在入院后2 d内留取静脉血标本实时进行检测。随访者每周留取1次标本，共8次。患者入院及治疗8周时均留取胆碱酯酶(cholinesterase，CHE)、球蛋白(globulin，GLB)、谷丙转氨酶、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素、凝血酶原活动度(prothrombin activity，PTA)等检测结果。以上数据均来自解放军第302医院临检中心。

4流式细胞仪检测ECR1的表达 藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记鼠IgG1和鼠抗人CR1单克隆抗体为美国BD Pharmingen公司产品；0.01 mol/L PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)为北京索莱宝公司产品。FACS Calibur流式细胞仪为美国BD Pharmingen公司产品。红细胞花环率实验用S180小鼠腹水肿瘤细胞购自上海博全尔生物科技有限公司。具体方法：留取抗凝血1 ml。取2支流式试管，取10μl全血加入试管1中，加入5μl PE标记鼠抗人CR1单克隆抗；另1试管为空白对照，加入10μl全血和5μl PE标记鼠IgG1。室温避光保存15 min；每管加入50μl PBS，混匀，避光15 min，离心、弃上清；PBS漂洗，吸弃上清，沉淀中加入300μl PBS，重悬红细胞，避光，即刻上机测试。

5红细胞花环实验 红细胞悬液的制备：抗凝剂全血离心(2 000 r/min，离心5 min)备用。肿瘤细胞悬液的制备：将小鼠S180腹水肿瘤细胞用0.9%氯化钠注射液洗涤1次，配成1×106/ml浓度悬液备用。ECR1黏附活性测定：取血清100μl，红细胞10μl，肿瘤细胞悬液100μl，混匀，37℃水浴30 min。阅片：取混匀液150μl，加50 ml瑞-吉氏染液混匀悬液涂片，悬浮涂片(玻片的2/3)，分上、中、下；左、中、右9区阅片，每区阅读10 12个肿瘤细胞，结合5个红细胞的肿瘤细胞为个结合单位，计算其结合率[2]。

6统计学处理 应用SPSS19.5软件，计量资料用-x±s表示，组间比较采用成组t检验；P＜0.0为差异有统计学意义。

结 果

1一般资料 对照组15例，男性9例，女性6例平均年龄30岁。HBV-ACLF组共31例，男性2例，女性4例，平均年龄46岁。治疗8周时在院HBV-ACLF患者根据疗效判断标准评估，19例无效，12例好转。完成8次随访的HBV-ACLF患者共9人。入组人群治疗前后检测指标见表1。

2ECR1在各组间表达比较 用流式细胞术检测ECR1结果如图1、图2所示，ECR1在健康组(62.30±13.22)的表达明显高于HBV-ACLF组(41.21± 14.33)，两组有统计学差异(t=3.33，P=0.021)。在HBV-ACLF患者中，8周后病情转归不同的患者入组时ECR1表达不同，好转组(47.31±16.36)较无效组(38.99±10.52)明显偏高，两组有统计学差异(t=1.95，P=0.049)，详见图1、图2。

3ECR1在各组间的黏附活性比较 入组时健康组黏附活性(66.33%±16.79%)较慢加急性肝衰竭组(45.55%±15.04%)高，有统计学差异(t=5.01，P 0.000)；在HBV-ACLF患者中，8周后病情转归不同的患者在入组时ECR1黏附活性好转组(47.21%± 26.52%)较无效组(43.72%±28.69%)明显偏高，但两组差异无统计学意义(t=0.45，P=0.654)。

4ECR1的表达及黏附活性动态观察 对完成次随访的9例HBV-ACLF患者ECR1表达量及黏附活性进行动态监测，观察8周时疗效。其中例病情好转，4例无效。如图3、图4所示，每个点为该组患者的均值。ECR1表达量及黏附活性在无效组整体表达水平较低，而好转组随着病情好转有上升趋势。

讨 论

CR1表达在许多类型的细胞表面，包括红细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、T和B淋巴细胞以及树突状细胞[3]，与补体C3b及C4b有高度亲和性[4]。红细胞是血液中数量巨大的天然免疫细胞，对于适应性免疫细胞产生的特异疫反应具有重大的生理作用和指导意义[5]。红细胞中广泛存在的CR1分子，在数量上虽然仅相当于白细胞膜上CR1分子的1% ～ 2%，但其成簇分布且单位容积血液中红细胞的数目大于白细胞3个数量级，其与循环免疫复合物、抗原物质及其他机体细胞接触的机会是白细胞的500 ～ 1 000倍。血液中的CR1 95%表达于红细胞膜上。红细胞通过CR1与抗原抗体复合物(immune complex，IC)上的C3b结合，引起红细胞钙离子内流，从而引起红细胞变形性增高，这一现象有助于红细胞将IC运送到肝、脾固定吞噬细胞[6-7]，ECR1是机体安全有效清除免疫复合物的物质基础；红细胞可竞争性地与抗原抗体复合物结合，消除过多抗原抗体复合物造成的免疫抑制，增加淋巴细胞、单核巨噬细胞功能，调节机体免疫功能。红细胞与各类白细胞构成了人体的天然免疫系统。

表1 入组人群肝功能指标Tab. 1 Clinical data about enrolled patients ()

表1 入组人群肝功能指标Tab. 1 Clinical data about enrolled patients ()

ItemsHealthy groupImproved groupIneffective group Before treatmentAfter treatmentBefore treatmentAfter treatment ALT (U/L)11.9±3.15226.1±431.545.0±21.5326.1±2 311111.1±78.5 AST (U/L)15.22±7.5132.11±169.277.6±101.2161.7±121.935 3221.4±122.5 TBIL (μmol/L)11.28±9.5293.52±142.8127.8±96.9293.52±142.89298.8±147.2 CHE (U/L)8 818.23±179.152 409.67±231.291 216.4±331.72 409.67±231.29984.7±871.1 PA (%)89.14±17.5935.37±11.6845.44±21.235.37±11.6828.5±9.7

图 1 对照组ECR1的表达Fig. 1 Expression of ECR1 in control group

图 2 HBV-ACLF患者ECR1的表达Fig. 2 Expression of ECR1 in patients with HBV-ACLF

图 3 CR1在不同预后HBV-ACLF患者的表达(流式)Fig. 3 Expression of CR1 in patients with HBV-ACLF

图 4 不同HBV-ACLF患者的红细胞黏附能力 (花环实验)Fig. 4 Adhesion activity of ECR1 in patients with HBV-ACLF

有文献表明[4,8]，正常人红细胞CR1分子的表达平均值显著高于肝癌、系统性红斑狼疮、大肠癌、卵巢癌以及风湿性心脏病病人。并且CR1分子的数量表达与疾病的病情呈显著相关性。目前很多抗肿瘤药物作用靶点也集中于此[9]。肝病的发病机制中免疫不平衡是最重要环节之一。目前还未见ECR1与肝衰竭相关性研究报道。本研究显示，HBV-ACLF患者外周血ECR1表达量及黏附活性较健康组明显下降。这一现象说明ECR1与肝坏死密切相关。肝炎性活动初期，肝细胞存在炎性改变或坏死[10]，ECR1发挥清除免疫复合物及免疫调节作用[11]，其数量及黏附活性下降；在此基础上如果其数量及黏附活性无恢复，将导致肝损伤的进一步加重。通过对HBV-ACLF患者随访发现，好转组患者ECR1在表达量及黏附活性方面都呈上升趋势，而无效组持续保持低水平状态。提示随着炎症或肝细胞坏死出现ECR1处于消耗状态，如果短期内可恢复，即红细胞免疫能力可恢复，意味着预后较好。CR1是调理素受体，可增强吞噬细胞摄取包被了C3b或C4b的颗粒或微生物的能力，促进吞噬且有利于巨噬细胞对抗原信息的传递，刺激其他免疫细胞而扩大免疫效应。体外实验表明，人CR1表达可提高对肺炎链球菌的免疫吸附作用，而被ECR1黏附的肺炎链球菌可递呈给巨噬细胞[12]。肝活动性炎症及病情加重可能与ECR1表达及黏附活性受损导致上述能力受损有关。既往多项研究亦显示，ECR1分子黏附活性水平持续较低的患者，其病情大多较重、预后较差[12-13]。

目前多项研究结果表明，CR1基因多态性与多种疾病相关[14-15]。在初步明确ECR1在慢性HBV感染患者尤其是HBV-ACLF患者外周血红细胞的表达及黏附活性改变后，我们将进一步行分子水平研究，以期获得更多ECR1与慢性HBV感染机制的关系。

1 中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组， 中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组. 肝衰竭诊治指南（2012年版［J］. 中华临床感染病杂志， 2012， 5（6）： 321-327.

2 王海滨，张景萍，郭峰，等.血细胞天然免疫粘附肿瘤细胞的现象及意义［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2001，21（3）：27-30

3 Rochowiak A， Niemir ZI. The structure and role of CR1 complemen receptor in physiology［J］. Pol Merkur Lekarski， 2010， 28（163）79-83.

4 李娟，张卓莉.补体系统与系统性红斑狼疮相关性研究进展［J中华风湿病学杂志，2013，17（6）：424-426.

5 房昭， 杨爱莲， 高福云， 等. 龙葵碱诱导人宫颈癌细胞HeLa凋亡的体外实验研究［J］. 华西药学杂志， 2010， 25（3）： 266-268

6 Glodek AM， Mirchev R， Golan DE， et al. Ligation of complemen receptor 1 increases erythrocyte membrane deformability［J］Blood， 2010， 116（26）： 6063-6071.

7 Karnchanaphanurach P， Mirchev R， Ghiran I， et al. C3b depositio on human erythrocytes induces the formation of a membrane skeleton linked protein complex［J］. J Clin Invest， 2009， 119（4）： 788-801

8 王海滨，张景萍，王辉，等.红细胞CR1分子的定量测定及其临床意义［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2000，20（4）101-104.

9 季宇彬，汲晨锋.芦笋多糖对肿瘤小鼠红细胞离子通道活性的影响［J］.中国食品学报，2014，14（7）：27-31.

10 佘为民.乙型肝炎病毒变异与重症肝炎关系探讨［J］.肝脏2004，9（2）：121-122.

11 Antúnez C， Boada M， López-Arrieta J， et al. Genetic associatio of complement receptor 1 polymorphism rs3818361 in Alzheimer’disease［J］. Alzheimers Dement， 2011， 7（4）： e124-e129.

12 Li J， Wang JP， Ghiran I， et al. Complement receptor 1 expression o mouse erythrocytes mediates clearance of Streptococcus pneumoniae b immune adherence［J］. Infect Immun， 2010， 78（7）： 3129-3135

13 张继万，王海滨，周建丽，等.肝炎肝硬化患者红细胞 CR粘附活性与肝功能损伤程度的相关性研究［J］.传染病信息2003，16（3）：130-131.

14 Yu X， Rao J， Lin J， et al. Tag SNPs in complement receptorcontribute to the susceptibility to non-small cell lung cancer［J］Mol Cancer， 2014， 13：56.

15 Schmidt C， Wolff M， Von Ahsen N， et al. CR1 is potentiall associated with rate of decline in sporadic Alzheimer’s disease［J］J Clin Neurosci， 2014， 21（10）： 1705-1708.

Expression and clinical signifcance of erythrocyte CR1 in patients with HBV-ACLF

LIU Xiaoyan, CHEN Yan, CHEN Jing, XIAO Long, TONG Jingjing, GUAN Chongdan, YAN Lilong Liver Failure Treatment and Research Center, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

Objective To study the expression and clinical significance of erythrocyte CR1 in patients with HBV-ACLF (HBV-acute-on-chronic liver failure). Methods A total of 31 HBV-ACLF patients and 15 healthy controls (HC) were enrolled in this study. Venous blood was extracted from 31 patients with HBV-ACLF and 15 healthy people. Flowcytometry was used to detect the expression of CR1 in patients with HBV infected liver diseases. RBC-C3bRR (RCR) was used for detection of CR1 immunity function. One tumor cell rounded by at least fve red cells was used as a rosette to calculate the ratios. HBV-ACLF patients were followed up for 8 weeks, and then they were divided into improved group and ineffective group according to the clinical effcacy. The changes of ECR1 in peripheral blood in improved group and ineffective group were observed dynamically. Results Our study showed that the expression of ECR1 was signifcantly higher in the control group than in the HBV-ACLF group [(62.30±13.22) vs (41.21±14.33), t=3.33, P=0.021], and the ECR1 expression and adhesion activity in patients with HBV-ACLF was higher in improved group after 8 weeks than in ineffective group [(47.31±16.36) vs (38.99±10.52), t=1.95, P=0.049], while there was no significant difference in adhesion activity between two groups. From dynamic view, expression and adhesion activity of ECR1 showed an increase in improved group, while a decline in ineffective group. Conclusion Expression and adhesion activity of ECR1 are correlated with the prognosis of HBV-ACLF. Patients with increased expression and adhesion activity of ECR1 have a better prognosis. Observation of ECR1 in patients with HBV-ACLF is of great clinical signifcance.

erythrocyte complement receptor 1; hepatitis B viruses; acute-on-chronic liver failure

R 512.62

A

2095-5227(2015)09-0904-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.09.013

时间：2015-06-12 16:45

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150612.1645.004.html

2014-11-20

刘晓燕，女，博士，主治医师。研究方向：肝衰竭的基础与临床。Email: fmlxy@sina.com

The frst author: LIU Xiaoyan. Email: fmlxy@sina. com