高　铎，孔令聪，贾博岩，王　梓，徐凤宇，刘树明，马红霞，2＊（.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春308；2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春308）



牛支原体致病机制研究进展

高铎1，孔令聪1，贾博岩1，王梓1，徐凤宇1，刘树明1，马红霞1，2＊
（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118）

摘 要：牛支原体是引起牛呼吸系统疾病的主要病原之一，给养牛业造成了严重的经济损失。论文对近期国内外关于其致病机制的研究进展进行梳理，以期为牛支原体肺炎的防控提供参考。对牛支原体致病机制的研究可为研制有效的疫苗和新型绿色药物及其他防控途径提供理论依据，进而在临床上有效控制牛支原体引发的疾病。论文涉及三方面内容：一是牛支原体黏附蛋白的黏附作用；二是牛支原体在黏附基础上其代谢产物对宿主细胞的损伤和相关蛋白介导的宿主细胞凋亡；三是免疫学致病机制，包括黏附蛋白的免疫原性及免疫逃避机制、宿主的免疫应答及炎症损伤和宿主的抗炎反应及免疫抑制机制。

关键词：牛支原体；致病机制；免疫学

牛支原体（Mycoplasma bovis）是引起犊牛肺炎、关节炎和成牛乳房炎的主要病原之一，以引起呼吸系统疾病最为多见［1］。自1961年美国首次分离到牛支原体以来，全世界大多数国家都已经发生过由牛支原体引起的相关疫情。继2008年我国首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体后，陆续证实我国部分地区发生了牛支原体肺炎疫情，给我国肉牛和奶牛养殖业造成了严重的经济损失［2］。由于牛支原体具有在牛体持续存在和条件性致病等特点，50年来其引起的疾病在兽医临床上一直缺乏有效的防控手段，既无有效疫苗，也无特效药物，且随着抗生素的不合理使用，使其耐药株出现的频率呈逐年增加趋势，给兽医临床治疗该病增加了困难。因此，在牛支原体致病机制研究的基础上研制有效的疫苗和新型绿色药物，在临床上控制牛支原体引发的疾病具有重要意义。国内外学者已经对牛支原体的致病机制开展了一些研究，主要包括牛支原体黏附蛋白对机体的黏附、牛支原体对机体的直接损伤和免疫学致病机制三个方面。

1　牛支原体黏附蛋白对机体的黏附作用

牛支原体感染的第一步是在宿主体内定殖，实现定殖的前提是黏附在相应的靶器官表面，如猪肺炎支原体可通过p97蛋白黏附于宿主呼吸道纤毛表面，随后蚕食纤毛，直至纤毛大面积脱落，无法排出异物及气管黏膜产生的分泌物，逐渐形成肺实变，肺脏功能受损，出现呼吸系统症状［4］。牛支原体菌体表面也存在与黏附相关的可变表面蛋白（variable surface proteins，Vsp）［5］和其他可能具有黏附作用的蛋白如pMB67、p26、p48、p68、24ku、28ku等［6］，其中牛支原体Vsp蛋白的C端具有抗原决定簇和黏附结构，在牛支原体对宿主细胞的黏附中起关键作用［7］。Song Zhiqiang等［8］在牛支原体全基因组测序的基础上，筛选得到了一个与牛支原体黏附机制相关的α-烯醇化酶（α-enolase）基因，并应用原核表达系统获得了这个基因的重组蛋白。利用α-enolase重组蛋白制备了抗牛支原体α-enolase的抗体，通过配体试验证明该重组蛋白具有纤溶酶原结合活性，验证了牛支原体膜蛋白结合纤溶酶原的能力与其存在的α-enolase密切相关。其还进一步应用黏附与黏附抑制试验对牛支原体α-enolase是否和牛支原体黏附宿主细胞具有相关性进行评定。结果表明，纤溶酶原可以明显的加强牛支原体黏附呼吸道上皮细胞的能力，并且这种能力会被抗牛支原体αenolase特异性的抑制。此外，课题组也在全基因组测序基础上，通过原核表达系统获得了两个与牛支原体黏附机制相关的重组蛋白vpmaX和p33，并利用激光共聚焦技术验证了其对牛呼吸道上皮细胞的黏附作用［9-10］。总之，黏附蛋白在牛支原体对宿主细胞的黏附中起主要作用，而猪肺炎支原体黏附宿主的病理学机制很可能在牛支原体的黏附机制中存在，但尚未得到证实。

2　牛支原体介导的细胞损伤

在牛支原体黏附的基础上，其代谢产物如核酸酶、H2O2等可对宿主细胞造成损伤。研究发现，淋巴细胞摄取核酸酶后可增强其对各种诱导因素引起凋亡的敏感性［11］；Schott C等［12］和Khan L A［13］研究证实，牛支原体可以分泌大量的H2O2。Lennon S V等［14］发现HL-60细胞在低浓度H2O2条件下可发生凋亡，在H2O2继续增高条件下可发生大量坏死。此外，相关研究也证实肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia，Mp）寄生宿主呼吸道上皮细胞表面后，可通过黏附端的微管插入宿主细胞，将局部代谢产生的H2O2和超氧阴离子（O2-）排入胞内，氧超载破坏细胞内触酶的活性，造成呼吸道上皮纤毛脱落、细胞肿胀、坏死、凋亡；且Mp产生的超氧阴离子能够抑制宿主细胞内过氧化氢酶活性，降低细胞内H2O2的降解，导致宿主细胞更易遭受氧化损伤［15］。牛支原体很可能与Mp具有相似的致病机制，通过其分泌的H2O2对宿主细胞造成损伤。

牛支原体还具有可介导宿主细胞凋亡的蛋白，通过介导宿主细胞凋亡而对机体造成损伤。自Tony J［16］在牛支原体上发现了可介导淋巴细胞凋亡的特异性蛋白后，Robino Patrizia等［18］在牛支原体上发现了具有诱导HL-60和U937细胞分化及凋亡功能的膜表面蛋白p48。另有研究表明穿透支原体（Mycoplasma penetrans，Mpe）和发酵支原体（Mycoplasma fermentans，Mf）的脂质相关膜蛋白（lipid-associated membrane proteins，LAMPs）可被Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）识别，激活NF-κB信号通路诱导凋亡［19-21］。

在证实牛支原体可介导细胞凋亡的同时，也有研究发现牛支原体尚具有抑制细胞凋亡的作用。Mulongo M等［22］发现牛支原体可以激活NF-κB的p65亚单位，抑制caspase-9的活性，延迟自发或者肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）/星孢菌素驱动的单核细胞凋亡，相关学者在其他支原体诱导细胞凋亡的研究中也有类似的发现［23］。

综上所述，牛支原体可产生造成细胞损伤的核酸酶、H2O2及影响宿主细胞凋亡的蛋白，从而使宿主致病。但牛支原体所产生的致病物质在宿主体内的损伤机制和NF-κB在牛支原体致病机制中的作用尚待进一步研究。

3　免疫学致病机制

3.1牛支原体的免疫原性及免疫逃避

牛支原体因具有可被识别的不同抗原表位的抗原蛋白pMB67、Vsp、p28等而具有免疫原性。研究证实，犊牛经呼吸道灌注牛支原体表达的VspA，48h后发生由巨噬细胞和中性粒细胞介导的先天免疫反应［24］。刘洋等［25］在对牛支原体全基因组测序和生物分析的基础上，通过原核表达系统表达了重组蛋白“p28”，并用免疫学方法验证其具有免疫原性，将纯化后的p28重组蛋白作为抗原建立了牛支原体血清抗体间接ELISA方法并组装成诊断试剂盒。孙文静等［26］通过建立牛支原体全菌蛋白的双向电泳体系，获得多个牛支原体蛋白，其中一个经质谱分析和氨基酸一级结构确定为硫辛酰胺脱氢酶（LipDH）。经原核重组表达，LipDH重组蛋白与牛支原体阳性血清的Dot-ELISA及以重组蛋白作为包被抗原的ELISA鉴定结果均为阳性，证明LipDH重组蛋白具有免疫原性。

Vsp因具有较高的变异频率而具有逃避宿主免疫的能力。Lysnyansky I等［27］发现牛支原体可通过ON/OFF开关变异机制形成多样化的支原体表面结构，以躲避宿主免疫。该机制主要受Vsp蛋白家族基因上游区的两个基因盒（cassette）调控，且目前已知的Vsp蛋白家族中各蛋白的cassette 1高度相似。cassette 2是Vsp蛋白家族基因的一个启动子，位于cassette 1的上游，该序列在重组酶的作用下能在不同Vsp蛋白间重组，以调控Vsp蛋白家族基因的转录功能，当有Vsp基因的cassette 2重组为一个特定的序列时，该蛋白即可表达，当有其他序列插入时，该Vsp基因沉默。

3.2宿主的免疫应答及炎症损伤

免疫应答中所产生的促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ的促炎作用和ROS、NO等物质对机体的损伤可能是牛支原体的重要致病机制之一。Tony J等［28］用牛支原体感染肉牛肺脏，用流式细胞仪分析感染牛T细胞亚型变化，发现牛支原体感染后的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中CD4+T细胞、CD8+T细胞和γδ-T细胞的含量明显增高；感染后的PBMCs产生的IFN-γ、IL-4水平都同等程度地升高，据此判断此感染模型兼具Th1和Th2两种细胞反应亚型。Francisco R等［29］发现，感染牛支原体的牛肺脏组织中，TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10都有所增加。Jungi T W等［30］发现牛支原体可以诱导巨噬细胞产生TNF-α和NO。

在正常情况下，机体内活性氧族（reactive oxygen species，ROS）的产生和清除处于动态平衡状态。如果机体内抗氧化物质不能有效降解ROS，就会使其在胞内蓄积引起氧化应激，进而导致DNA氧化损伤和蛋白质表达异常，对机体造成损害。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在ROS的形成过程中起重要作用。Hermeyer K［31］证实在感染牛支原体的牛坏死部位周围的巨噬细胞和退化的支气管上皮细胞有大量NOS、SOD、硝基酪氨酸（nitrotyrosine，NT），且巨噬细胞分泌的NO可能降低了MHCⅡ类分子的抗原呈递能力［32］。

总之，牛支原体感染宿主后的免疫应答中所产生的促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ引起的炎症反应，以及ROS、NO等物质所造成的机体氧化应激损伤可能是M.bovis的重要致病机制之一。

3.3牛支原体的抗炎作用及对机体免疫功能的抑制

因IL-4和IL-10等抗炎细胞因子过量释放所造成的机体过于强烈的内源性抗炎反应被称为代偿性抗炎反应综合征（CARS）［33］。CARS及牛支原体对机体免疫功能的抑制可以使宿主免疫功能降低和易感染性增加。Jacques van der Merwe等［34］通过淋巴细胞增殖试验证实，正常生长和经热处理死亡的牛支原体均可以感染所有PBMCs并抑制其增殖，但并不影响CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和γδ-T细胞分泌IFN-γ，认为牛支原体是通过抑制淋巴细胞增殖来降低机体免疫水平的。Rodríguez F等［29］证实感染牛支原体的牛肺脏组织中IL-10有所增加。Mulongo M等［22］也研究发现牛支原体感染后的单核细胞不能产生TNF-α，且IL-10的含量增高，并推测牛支原体可能是通过TLR2和TLR6介导激活NF-κB的。Tony J等［7］发现牛支原体可分泌一种具有免疫抑制活性的多肽，能降低细胞分裂素介导的淋巴细胞增殖作用，从而减轻宿主的免疫反应，并且验证其体外重组蛋白亦能降低刀豆素介导的淋巴细胞增殖，该多肽的N末端与VspL蛋白C末端的26个氨基酸具有84%的同源性。Thomas C B等［35］通过化学发光法发现牛支原体能抑制蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活剂佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）诱导的呼吸暴发，从而抑制细胞氧化代谢活性及氧自由基的形成能力。PKC能通过细胞膜结合NADPH氧化酶的磷酸化作用引发呼吸暴发，产生大量ROS，因此牛支原体可能抑制中性粒细胞的活性，同时抑制呼吸暴发的产生，从而降低宿主的免疫反应。Wiggins M C等［36］也证实牛支原体可以抑制中性粒细胞产生ROS。

总之，在感染后期，牛支原体可能通过IL-10等抗炎细胞因子的释放、分泌免疫抑制活性的多肽、抑制中性粒细胞等途径，降低机体的免疫功能。在其他支原体如猪肺炎支原体的致病机制中未见关于降低机体免疫功能的相似报道［37］，此机制的存在不但为牛支原体在宿主内长期生存提供了条件，还可能是其与其他病原如多杀性巴氏杆菌多发混合感染的主要原因。

4　小结与展望

牛支原体的致病机制可能为病原体首先黏附于宿主呼吸道上皮细胞，随后通过释放局部代谢产物、毒素等直接损害宿主防御系统，或诱导宿主细胞凋亡；且可进一步激活宿主炎症细胞，引发炎症反应，损伤宿主；在感染后期，通过抑制机体的免疫功能，从而在宿主体内长期存在，或者引起继发感染。在牛支原体致病过程中，各致病因素的分泌水平、调控机制及对机体的影响可能随感染时间不同和病情发展变化而有一定差异。因此，进一步研究牛支原体各致病因素如黏附蛋白、细胞因子及ROS的分泌水平及动态变化规律、阐明牛支原体脂蛋白或其他分泌物如何结合TLRs，激活包括NF-κB在内的各种信号通路，产生不同细胞因子继而触发的促炎和抗炎作用及调控机制，将为从预防和控制牛支原体引发的疾病奠定理论基础。

参考文献：

［1］ 张 瑞，崔 朋，巴晓亮，等.牛支原体临床分离株牛体毒力和免疫原性比较［J］.动物医学进展，2013，34（6）：126-132.

［2］ 辛九庆，李 媛，郭 丹，等.国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体［J］.中国预防兽医学报，2008，30（9）：661-664.

［3］ 伍晓红，储岳峰，张 轩，等.牛支原体的分离鉴定及16S rRNA基因序列分析［J］.动物医学进展，2012，33（12）：35-37.

［4］ 杜海霞，刘茂军，冯志新，等.猪肺炎支原体及其他支原体黏附因子的研究进展［J］.现代生物医学进展，2012，12（5）：984-987.

［5］ Lysnyansky I，Sachse K，Rosenbusch R，et al.The vsp locus of Mycoplasma bovis：gene organization and structural features ［J］.J Bacteriol，1999（181）：5734-5741.

［6］ 陈忠琼，范 媛，黎晓敏.牛支原体生物学特性及其膜蛋白的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2012，39（2）：183-186.

［7］ Vanden Bush T J，Rosenbusch R F.Characterization of a lympho-inhibitory peptide produced by Mycoplasma bovis［J］.Biochem Biophy Res Commun，2004（315）：336-341.

［8］ Song Zhiqiang，Li Yuan，Liu Yang，et al.α-enolase，an adhesion-related factor of Mycoplasma bovis［J］.PLoS One，2012，7 （6）：e38836.

［9］ Zou Xiaohui，Li Yuan，Liu Yang，et al.Molecular cloning and characterization of a surface-localized adhesion protein in Mycoplasma bovis Hubei-1 strain［J］.PLoS One，2013，8（7）：e69644.

［10］ 邹晓辉，李 媛，汪 洋.牛支原体表面一种新的膜蛋白（P33）的特性研究［J］.中国预防兽医学报，2013，35（4）：255-258.

［11］ 吴移谋，叶元康.支原体学［M］.北京：人民卫生出版社，2008：44-45.

［12］ Schott C，Cai H，Parker L，et al.Hydrogen peroxide production and free radical-mediated cell stress in Mycoplasma bovis pneumonia［J］.J Comp Pathol，2014，150（2-3）：127-137.

［13］ Khan L A，Miles R J，Nicholas R A J.Hydrogen peroxide production by Mycoplasma bovis and Mycoplasma agalactiae and effect of in vitro passage on a Mycoplasma bovis strain producing high levels of H2O2［J］.Vet Res Commun，2005，29 （3）：181-188.

［14］ Lennon S V，Martin S J，Cotter T G.Does-dependent induction of apoptosis in human tumour or cell lines by widely diverging stiumuli［J］.Cell Prolif，1991，24（2）：203-214.

［15］ 王贵清，王立波.肺炎支原体致炎症机制的研究进展［J］.中外医学研究，2013，11（24）：152-153.

［16］ Tony J，Bush V，Rosenbusch R F.Mycoplasma bovis induces apoptosis of bovine lymphocytes［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2002（32）：97-103.

［17］ Robino P，Alberti A，Pittau M，et al.Genetic and antigenic characterization of the surface lipoprotein P48of Mycoplasma bovis［J］.Vet Microbiol，2005（109）：201-209.

［18］ Hall R E，Agarwal S，Kestler D P.Induction of leukemia cell differentiation and apoptosis by recombinant P48，a modulin derived from Mycoplasma fermentans［J］.Biochem Biophy Res Commun，2000，269（1）：284-289.

［19］ 曾焱华，吴移谋，余敏君，等.穿透支原体LAMPs诱导NF-κB激活介导小鼠巨噬细胞凋亡［J］.微生物学报，2008，48（3）：355-361.

［20］ Into T，Nodasaka Y，Hasebe A，et al.Mycoplasmal lipoproteins induce Toll-like receptor 2and caspases-mediated cell death in lymphocytes and monocytes［J］.Microbiol Immunol，2002，46（4）：265-276.

［21］ Into T，Kiura K，Yasuda M，et al.Stimulation of human Toll-like receptor（TLR）2and TLR6with membrane lipoproteins of Mycoplsam fermentans induces apoptotic cell death after NF-κB activation［J］.Cell Microbiol，2004，6（2）：187-199.

［22］ Musa M，Prysliak T，Scruten E，et al.In vitro infection of bovine monocytes with Mycoplasma bovis delays apoptosis and suppresses production of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha but not interleukin-10［J］.Infection and Immunity，2014，82（1）：62.

［23］ Gerlic M，Horowitz J，Horowitz S.Mycoplasma fermentans inhibits tumor necrosis factorα-induced apoptosis in the human myelomonocytic U937cell line［J］.Cell Death and Differentiation，2004（11）：1204-1212.

［24］ Buchenau F，Poumarat D，Grand L，et al.Expression of Mycoplasma bovis variable surface membrane proteins in the respiratory tract of calves after experimental infection with a clonal variant of Mycoplasma bovis type strain PG45［J］.Res Vet Sci，2010（3）：1-7.

［25］ 刘 洋.牛支原体P28基因的表达及间接ELISA方法的建立［D］.北京：中国农业科学院，2011.

［26］ 孙文静，李 媛，宋志强.牛支原体免疫相关性蛋白硫辛酰胺脱氢酶的筛选与鉴定［J］.中国预防兽医学报，2012，34（10）：761-765.

［27］ Lysnyansky I，Ron Y，Yogev D.Juxtaposition of an active promoter to Vsp genes via site-specific DNA inversions generates antigenic variation.［J］J Bacteriol，2001，183（19）：5698-5708.

［28］ Vanden Bush T J，Rosenbusch R F.Characterization of the immune response to Mycoplasma bovis lung infection［J］.Vet Immunol Immunopathol，2003（94）：23-33.

［29］ Rodríguez F，González J F，Arbelo M，et al.Cytokine expression in lungs of calves spontaneously infected with Mycoplasma bovis［J］.Vet Res Commun，DOI 10.1007/s11259-014-9620-3.

［30］ Jungi T W，Krampe M，Sileghem M，et al.Differential and strain-specific triggering of bovine alveolar macrophage effector functions by mycoplasmas［J］.Microbial Pathogenesis，1996（21）：487-498.

［31］ Hermeyer K，Jacobsen B，Spergser J，et al.Detection of Mycoplasma bovis by in-situ hybridization and expression of inducible nitric oxide synthase，nitrotyrosine and manganese superoxide dismutase in the lungs of experimentally-infected calves［J］.J Compar Pathol，2011，145（2-3）：240-250.

［32］ Hermeyer K，Buchenau I，Thomasmeyer A，et al.Chronic pneumonia in calves after experimental infection with Mycoplasma bovis strain 1067：characterization of lung pathology，persistence of variable surface protein antigens and local immune response［J］.Acta Vete Scand，2012（54）：9.

［33］ 石云峰.炎性细胞因子在细菌感染中的作用［J］.国际内科学杂志，2009，36（2）：112-115.

［34］ van der Merwe J，Prysliak T，Perez-Casal J.Invasion of bovine peripheral blood mononuclear cells and erythrocytes by Mycoplasma bovis［J］.Infect Immun，2010，78（11）：4570.

［35］ Thomas C B，Van Ess P，Wolfgram L J，et al.Adherence to bovine neutrophils and suppression of neutrophil chemiluminescence by Mycoplasma bovis［J］.Vet Immunol Immunop，1991，27（4）：365-381.

［36］ Wiggins M C，Woolums A R，Hurley D J，et al.The effect of various Mycoplasma bovis isolates on bovine leukocyte response［J］.Comp Immunol Microbiol Infect Dis，2011（34）：49-54.

［37］ 李彦伟，刘茂军，武昱孜，等.猪肺炎支原体致病机理研究进展［J］.动物医学进展，2013，34（8）：84-88.

Progress on Pathogenic Mechanism of Mycoplasma bovis

GAO Duo1，KONG Ling-cong1，JIA Bo-yan1，WANG Zi1，XU Feng-yu1，LIU Shu-ming1，MA Hong-xia1，2
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin，130118，China；2.Animal Production &Product Quality and Security，Ministry of Education，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin，130118，China）

Abstract：In recent years，Mycoplasma bovis has become one of the main pathogens causing bovine respiratory disease，poses a huge economic losses to cattle industry.This article reviewed the recent progress on pathogenic mechanism of Mycoplasma bovis in the domestic and overseas in order to provide a reference for prevention and control pneumonia disease caused by Mycoplasma bovis.Research on pathogenic mechanism of Mycoplasma bovis will provide theoretical basis for development of effective vaccine and new type of green drugs and other approaches of prevention and control，and then could effectively control the disease induced by Mycoplasma bovis in the clinic.This article summarized from following three aspects. Firstly，the role of Mycoplasma bovis adhesion protein on adhesion；Secondly，the injury to host cells by metabolites and the apoptosis mediated by related proteins；Thirdly，immunological pathogenic mechanisms including immunogenicity and immune evasion of adhesion protein，the immune response and inflammatory lesions of the host，the anti-inflammatory response and immunosuppression of the host.

Key words：Mycoplasma bovis；pathogenic mechanism；immunology

作者简介：高 铎（1989-），男，吉林桦甸人，硕士研究生，主要从事动物药理与毒理学研究。＊通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目（31272611）；教育部新世纪优秀人才项目（NCET-10-0174）；吉林省世行贷款农产品质量安全项目（2011-Y05）；吉林省牧业管理局项目（20120113）

收稿日期：2014-12-05

中图分类号：S852.62

文献标识码：A

文章编号：1007-5038（2015）07-0090-05