马 涛 刁其玉

(中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点实验室，北京100081)



瘤胃微生物多样性与定量

马 涛 刁其玉*

(中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点实验室，北京100081)

反刍动物由于瘤胃微生物的存在能够分解并利用饲料中的纤维素来提供能量和蛋白质。瘤胃微生物主要包括细菌、真菌和原虫，三者在消化饲料过程中分工明确，共同实现碳水化合物和蛋白质的分解。本文综述了定量瘤胃微生物群落多样性的新方法，尤其是分子生物学的应用，进一步提高人们对于瘤胃功能的认识水平。

瘤胃微生物；细菌；古细菌；厌氧真菌；原虫

瘤胃具有复杂的微生物区系，主要包括细菌、原虫和真菌这3大类，由于微生物的功能使得反刍动物能够利用饲料中的营养成分生成挥发性脂肪酸以及微生物蛋白质[1]，因此瘤胃微生物的研究是反刍动物营养领域一个永恒的课题，直到20世纪80年代16S rRNA基因序列分析技术出现之前，研究人员广泛应用培养基的方法对微生物进行研究，涉及到分离、计数以及功能鉴定等技术步骤，应用该方法目前已经完成了200多种细菌和100多种原虫及真菌的鉴定。事实上，虽然培养基技术能够有效地分离有代表性的瘤胃微生物，但其并不能反映瘤胃微生物的整体多样性，因为能被培养的瘤胃微生物数量仅占总微生物数量的不到20%[2]。过去的10年间，高通量测序技术的发展为研究瘤胃微生物多样性提供了极大的便利。利用实时定量PCR技术研究发现一些不可培养的细菌数量甚至与大多数能够培养的细菌数目一样丰富，由此可能证明前者同样在瘤胃发酵中起着重要作用[3]。此外，微生物多样性不仅仅受到饲粮组成的影响[4]，同时也受到宿主遗传背景[5]和环境因素[6]的影响。

1 瘤胃细菌

1.1 瘤胃细菌多样性定量研究

每克瘤胃内容物中的瘤胃细菌数量通常能够达到1010～1011个[7]，Kim等[3]利用16S rRNA基因测序技术系统研究了反刍家畜瘤胃中占主导地位的13 478种细菌和3 516种古细菌的序列，发现瘤胃中存在着7 000种细菌和1 500种古细菌，这7 000种细菌归属于19个门，其中硬壁菌门(Firmicutes,57.8%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,26.7%)和变形菌门(Proteobacteria,6.9%)在数量上占据主导地位。硬壁菌门中，梭菌纲(Clostridia)占90%以上，另外包括杆菌(Bacilli)、产芽胞菌(Erypsipelotrichi)和其他未分类的细菌。梭菌纲中，毛螺科菌(Lachnospiraceae,23.8%)、瘤胃菌(Ruminococcaceae,25.8%)和韦荣球菌(Veillonellaceae,7.7%)是最大的科，包含丁酸弧菌(Butyrivibrio,4.8%)、醋酸弧菌(Acetivibrio,4.5%)、瘤胃球菌(Ruminococcus,4.1%)、琥珀酸菌(Succiniclasticum,3.7%)、假丁酸弧菌(Pseudobutyrivibrio,2.3%)和Mogibacterium(2.3%)等主要的属；拟杆菌门中，绝大多数细菌属于拟杆菌纲(Bacteroidia,88.5%)，此外还有鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria,1.0%)和未分类的拟杆菌(10.5%)。拟杆菌纲包含15个属，其中普氏菌(Prevotella)为主要的属(41.5%)，鞘脂杆菌纲则只包含2个属。Bekele等[8]同样通过16S rRNA基因测序技术发现绵羊瘤胃中大部分普氏菌(87.8%)的序列与已知普氏菌序列的相似度低于97%，表明不可培养的普氏菌数量远超过已知的普氏菌，其特定的生理功能也有待于探索。变形菌门共包括5个纲，其中α变形菌纲(Alphaproteobacteria)中数量最多的为苯基杆菌属(Phenylobacterium,32.8%)；β变形菌纲(Betaproteobacteria)中数量最多的为水杆菌属(Aquabacterium,32.4%)；γ变形菌纲(Gammaproteobacteria)中数量最多的为嗜冷杆菌(Psychrobacter,>58%)，然而嗜冷杆菌是严格的好氧嗜冷菌[9]，考虑到瘤胃内的无氧环境以及温度(38.5～40.5 ℃)，嗜冷杆菌的存在还需要进一步证实；δ变形菌纲中数量最多的则为脱硫弧菌(Desulfovibrio)。

定量瘤胃微生物的方法包括荧光原位杂交(fluorenceinsituhybridization,FISH)、印迹杂交和16S/18S rRNA/rDNA(rrs)技术。纤维分解菌是反刍动物瘤胃中一类重要的细菌，随着定量技术的发展，人们对于其认识逐步深入。通过印迹杂交方法得出的瘤胃主要纤维分解菌产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球(菌)只占总瘤胃细菌群落的10%以下[10]；应用FISH技术进一步得出该3种菌占瘤胃总纤维分解菌的50%左右[11]；随后通过实时定量PCR定量分析得到产琥珀酸丝状杆菌是最主要的纤维分解菌[12]。rrs技术是近年来最常用的微生物定量手段，Jami等[13]以16头采食同一饲粮的奶牛为研究对象定量其瘤胃微生物区系，发现虽然区系在个体间存在显著差异，但几乎所有奶牛的瘤胃中均存在共同的32个细菌属，由此可见反刍动物瘤胃中存在着共享的核心菌群。Jami等[14]进一步对上述核心菌群进行分析并定量了13种关键功能菌的丰度，发现不同个体间核心菌群的丰度差异变化也极为显著，例如反刍真杆菌(Eubacteriumruminantium)的丰度在不同个体间相当稳定，而埃氏巨球菌(Megasphaeraelsdenii)的丰度在不同个体间差异幅度可达3倍；Pitta等[15]利用基于16S rRNA的扩增子测序技术，得出当肉牛由饲喂低蛋白质高纤维的狗牙根(Bermudagrass)向高蛋白质高可溶性营养物的冬小麦(Triticumaestivum)转换时，普氏菌的比例由28%上升到56%，是瘤胃中比例最高的菌属。对于瘤胃细菌群落变化的研究，可利用的手段包括限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)和单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)分析等。Jarvis等[16]利用RFLP研究了牛链球菌多样性受饲粮精粗比例变化的影响情况；Kocherginskaya等[17]利用DGGE和TGGE手段研究表明高谷物饲粮饲喂的牛瘤胃细菌群落丰富度要显著高于高粗料饲粮饲喂的肉牛。将不同分子生物学手段结合，有利于更好地反映瘤胃细菌受饲粮影响的变化情况。

1.2 瘤胃古细菌多样性定量研究

反刍动物瘤胃中存在的古细菌基本为产甲烷菌[18]，每克瘤胃内容物中的古细菌基因拷贝数量在108～1010之间[19]，绝大部分(99.6%)属于广古菌门(Euryarchaeota)，其中90%以上的序列与甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter,50%)、甲烷微菌属(Methanomicrobium,15%)和甲烷球形菌属(Methanosphaera,13%)等产甲烷菌属相关[3]。上述产甲烷菌的主导地位使其在利用氢气(H2)和二氧化碳(CO2)等发酵产物时更具有竞争力，从而能够迅速生长，与此对应，反刍动物甲烷排放的降低也直接与产甲烷菌生长受抑制相关。虽然首次分离产甲烷菌至今已有50多年[20]，但相当长的一段时间以来对于其了解程度远不如瘤胃细菌，而随着微生物分析技术的发展，人们逐渐开始探究产甲烷菌和其他瘤胃微生物之间，以及不同种属产甲烷菌的相互影响作用。Yanagita等[21]利用FISH技术得出游动甲烷微菌(Methanomicrobiummobile)占绵羊瘤胃总甲烷菌的54%左右；Soliva等[22]同样通过FISH技术阐明了月桂酸和肉豆蔻酸共同作用抑制甲烷菌生长的机理；Ohene-Adjei等[23]通过分析古细菌16S rRNA基因克隆文库，首次证明了瘤胃原虫对古细菌的种类存在直接影响；Mosoni等[19]利用DGGE技术研究发现尽量去原虫能够显著降低甲烷排放量，但主要产甲烷菌的丰度和多样性均不受去原虫的影响；Leahy等[24]对甲烷短杆菌进行了全基因组测序，这也是首个得到完整序列的瘤胃古细菌，上述研究者发现其含有大量编码表面黏附蛋白的基因，而这些蛋白质的发现可能有助于研究者更有针对性地开发相应疫苗，从而抑制甲烷菌的产生以及甲烷的排放。自2006年以来，大气甲烷的产生量以每年0.4%的速率增加[25]，甲烷减排日益成为研究热点，应用生物技术能够针对反刍动物主要的甲烷来源--古细菌进行直接分析，有助于人们更好地阐明瘤胃甲烷产生或抑制的相关机理。

2 瘤胃原虫

长期以来显微技术是对原虫进行鉴定和计数的理想方法，由此得到每克瘤胃内容物中原虫数量为105～106个，其中95%以上的为内毛虫(Entodinium)[26]。近年来，分子技术越来越多地被应用于原虫种属间差异的研究。Sylvester等[27]利用DNA指纹技术就饲粮对奶牛瘤胃和十二指肠原虫多样性展开研究，发现了尖尾内毛虫(Epidiniumcaudatum)、有尾内毛虫(Entodiniumcaudatum)和原口等毛虫(Isotrichaprostoma)为主要的种类；Skillman等[28]采集了100只绵羊的瘤胃液样品，通过18S rRNA基因测序技术发现不同时间点同一个体的原虫数量相对稳定，但在不同个体间每克瘤胃内容物中内毛虫的数量波动范围在1～106之间，因此如果想获得统计学上的差异显著性，每个试验处理须至少采集52个样品；Tymensen等[29]利用末端限制性片段长度多样性(T-RFLP)分析比较了饲喂干草的肉牛和饲喂青贮/谷物饲料的肉牛瘤胃原虫区系，发现饲喂青贮/谷物饲料的肉牛瘤胃中内毛属原虫(Entodiniumspp.)的丰度以及原虫多样性(香侬指数)较饲喂干草的肉牛更高，此外同圈饲养的肉牛在瘤胃原虫区系上更倾向于一致，该研究也是首次在瘤胃原虫上应用T-RFLP技术与传统的显微技术进行对比，从结果来看T-RFLP技术能够很好地对显微结果进行补充说明。

3 瘤胃真菌

瘤胃真菌只占到瘤胃总微生物量的10%左右，且受饲粮和个体显著影响[2]。由于真菌18S rRNA序列具有高度保守性，因此无法利用该序列对其进行鉴定或比较[30]，而真菌rRNA的内转录间隔区序列(internal transcribed spacer sequence,ITS)具有高度可变性，为区分不同的真菌类型提供了依据[31]。随后该技术不断得到改进，Denman等[32]通过自动分析的方法能够区分3个不同属[根囊鞭菌属(Orpinomyces)、梨囊鞭菌属(Piromyces)和新丽鞭毛菌(Neocallimastix)]的真菌品种；Griffith等[33]和Liggenstoffer等[34]通过分离包括反刍动物和单胃动物在内的数种食草动物瘤胃及粪便中的厌氧真菌，并将其归为新的门类——新美鞭菌门(Neocallimastigomycota)。在Liggenstoffer等[34]的研究中共获得了267 286条能够代表全部已知真菌属的序列，其中梨囊鞭菌属数量最多，占总序列的36%；枝梗鞭菌属(Cyllamyces)和根囊鞭菌属则最少，分别只占总序列的0.7%和1.1%，此外有多达38.3%的序列并不属于已鉴定的6个属，而是形成了8个在发育上差异显著的新型谱系。Youssef等[35]利用高通量测序和单分子实时测序技术，阐明了根囊鞭菌属中C1A菌株降解木质纤维素的相关机制，但目前为止关于瘤胃真菌的研究报道仍然不多。

4 瘤胃噬菌体

瘤胃中的噬菌体含量丰度，每毫升瘤胃内容物中噬菌体数量为107～109个[36]，然而人们对其多样性及功能作用仍知之甚少。Berg等[37]首次对牛瘤胃病毒组进行了全基因组分析，鉴定出28 000种不同的病毒基因型，然而其中高达78%的基因型与以知基因型并不匹配；前噬菌体的数量约为溶解性噬菌体的2倍，而绝大多数噬菌体和前噬菌体与瘤胃中占主导地位的门类(硬壁菌、拟杆菌和变形菌)密切相关。

5 瘤胃微生物区系的建立

在过去的20年时间里，法国农业科学院的研究人员通过对无菌条件下出生的羔羊在不同条件下瘤胃微生物生长情况开展了一系列研究[38-40]。近年来Jami等[41]应用焦磷酸测序技术对1日龄～2岁的反刍动物瘤胃细菌组成开展了研究，表明瘤胃微生物区系在出生后迅速建立，一致出现好氧和兼性厌氧微生物数量的下降，以及厌氧微生物数量的上升；一些瘤胃细菌在动物出生第1天就具备功能，且在采食固体饲料前其功能已相当完备。出生后的反刍动物瘤胃微生物区系可通过接触母体的产道、乳头、皮肤和唾液等建立，这种微生物区系的建立有利于瘤胃上皮的正常发育，从而能够保证正常的瘤胃发酵和消化功能，维持动物健康生长。

6 小 结

瘤胃微生物群落是反刍动物独有的生物平衡体系，是反刍动物的生命和生产基础，是一个需要无止境探索和研究的发酵实体，而基于核酸的分离鉴定技术逐渐成为研究瘤胃微生物种类及其在瘤胃中扮演角色的重要手段。2011年，瘤胃微生物组织(新西兰)开启了“Hungate 1000”项目，旨在建立1 000种可培养的瘤胃细菌、古细菌、厌氧真菌和纤毛虫的全基因组序列，能够代表瘤胃中最主要的微生物多样性。该项目的启动与实施具有重要意义，例如通过发现编码降解纤维活性的新基因用于提高动物生产性能、饲料原料解聚、生产生物燃料，或通过对古细菌全基因组序列的测定更有效地降低甲烷排放。随着现代科学的发展，瘤胃微生物的奥妙正在逐步被发现，其活动原理也在逐层被揭示，瘤胃微生物发生发展是微观也是宏观的，正期待人们用更进一步的手段去发现和解密。

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*Corresponding author, professor, E-mail: diaoqiyu@caas.cn

(责任编辑 王智航)

Rumial Microbes: Diversity and Quantification

MA Tao DIAO Qiyu*

(FeedResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofFeedBiotechnologyoftheMinistryofAgriculture,Beijing100081,China)

Ruminants are able to utilize fibrous feed as a source of energy and nutrients due to the ruminal microbes, composed mainly of bacteria, fungi, and ciliate protozoa. Ruminal microbes play different roles in feed digestion and act synergistically to ferment dietary carbohydrates and proteins. This review reported the latest methods for assessment of ruminal microbial diversity, particularly molecular techniques, which allows people to gain new insights into rumen functions. [ChineseJournalofAnimalNutrition, 2015, 27(12)：3649-3654]

ruminal microbes; bacteria; archaea; anaerobic fungi; protozoa

10.3969/j.issn.1006-267x.2015.12.001

2015-07-02

农业部公益性行业(农业)科研专项“南方地区幼龄草食畜禽饲养技术研究”(201303143)；国家肉羊产业技术体系建设专项资金(CARS-39)

马 涛(1986—)，男，山东青岛人，博士，从事反刍动物生理营养研究。E-mail： matao@caas.cn

*通信作者：刁其玉，教授，博士生导师，E-mail： diaoqiyu@caas.cn

S823;S826

A

1006-267X(2015)12-3649-06