*基金项目：天津市农业科学院院长基金项目（15004）

摘要：本文介绍了大豆转基因中常用的方法：农杆菌介导法、电击法、PEG转化法、基因枪法、花粉管通道法等转基因的技术方法的研究进展及其在大豆抗虫、抗病、抗除草剂等方面转化外源基因上的应用状况。

文献标志码：A

文章编号：1674-3547(2015)05-0018-09

收稿日期：2015－08－25

第一作者：姚丙晨，硕士，研究实习员，从事大豆与水稻基因功能组学研究

Transgenic Techniques and Application in Soybeans

YaoBingchen,YanShuangyong,Sujingping,MaZhongyou,WangXiaojing,SunYue, LiuXuejun

（Tianjin Crop Research Institute, Tianjin 300112, China）

Abstract: This article introduced the recent development of common used transgenic techniques in soybeans, including agrobacterium medium, electro- pulse method, PEG, particle bombing, and transformation in situ mediated by agrobacterium. The application of these techniques in insect pest resistance, disease resistance, herbicide resistance were summarized.

Key words: Soybean; Transgenic method; Progress

当生物学进入分子生物学时代以后，有关大豆的科学研究也进入快速发展的时期，尤其大豆的基因工程研究工作给生产上带来了巨大的经济效益。但是相对于水稻、烟草等作物来说，大豆的高效遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一。

植物转基因有很多的方法，主要分为农杆菌介导转化、植物病毒载体介导的基因转化、DNA直接介导的基因转化、种植系统介导等，其中，DNA直接介导的基因转化包括：PEG法、基因枪法、显微注射法、超声波法、激光微束法、电激法等；种植系统介导包括花粉管通道法、萌动种胚浸泡法、胚囊和子房注射法等 [1-2]。大豆转基因的方法主要有，农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、电激法、花粉管通道法和显微注射法，其中农杆菌介导法和基因枪法为主要的研究方法 [3]。

1　农杆菌介导大豆遗传转化

农杆菌介导遗传转化是利用生物学载体和农杆菌把理想的外源基因导入到植物基因组中 [4-5]。其具有操作简单，成本低，遗传稳定，整合完整，拷贝数少，甚至是单拷贝以及受目的基因分子量限制小的优点而广泛应用于植物遗传转化 [6-7]。农杆菌介导大豆的遗传转化利用的外植体有子叶节、未成熟胚、幼胚悬浮培养、胚尖 [8-12]。最初的方法依赖于大豆对农杆菌感染的易感性和植株再生的可用性的基因型 [8, 13-14]。最近几年的研究进展，如下所述，已经克服了这些缺点 [15-17]。

通过农杆菌侵染吸胀成熟种子和未成熟的子叶节已经成功的得到了转基因大豆和较好的重复率 [8, 18-21]。子叶节区域包含子叶和下胚轴之间交界处的腋芽生分生组织。腋芽分生组织的增殖和再生，通过在含有细胞分裂素—6-BA上形成多个不定芽实现的。芽体形成的能力外植体的基因型起主要作用，大多数基因型都它可以在子叶节点形成不定芽。在一般的情况下外植体需要用手术刀或小针预先制造一个伤口，但是这需要良好的实验技能来为细菌准备充分的靶组织供其侵染，相比之下，实验人员通过微型刷就可以很容易的创造出来均匀的伤口组织 [21-24]。

在固体的共培养培养基中加入抗氧化剂L-半胱氨酸和巯基化合物可以显着地提高子叶节初细胞的转化效率 [20, 23]和转基因植株的再生效率 [17,20,23]。抗氧化剂可以通过抑制伤口和病原体发生的反应，从而增加农杆菌介导法的转化效率 [20]。抗氧化剂组合，超级双元载体，乙酰丁香酮可以提高效率和大豆基因型的转化能力 [26-28]。第一个转基因大豆是以抗卡那霉素的nptII基因为标记基因产生的 [8]。现在是通过bar基因和抗除草剂基因筛选转化细胞，筛选浓度极大地影响了转化率，因此，对不同的大豆基因型要选择适当的不同浓度 [22, 29]。

这些被改进的转化体系被广泛的应用于许多的国内品种，比如，合丰35、合丰25、绥农14、东农50、东引小粒豆、东农42等 [30-34]。农杆菌介导转化大豆的效率是0.2%到10% [19-20, 29, 35]，大豆的转化效率依然依赖于实验人员的技术和大豆的基因型。和基因枪相比，农杆菌介导的转化效率依然比较低。

2　基因枪

粒子轰击，也被称为基因枪或基因枪技术，指用涂有目的基因的小钨或金颗粒朝目标植物细胞轰击 [36]。自从1988年第一次基因枪转化大豆获得成功后，科学家先后以未成熟种子的分生组织、茎尖分生组织、体细胞胚组织为外植体进行基因枪转化获得成功 [37-39]。

最初体细胞胚是作为农杆菌介导遗传转化的目标，后来发现它更适合于粒子轰击转化 [38, 40-42]。1983年，Christianson等 [43]首先报道了大豆体细胞发生，未成熟子叶体细胞胚在含有高浓度生长素，如2,4-D中诱导，用于生成增殖胚培养和恢复整个植物 [44-48]。由于增生胚组织的形成取决于基因型，因此利用转化的基因型一直局限于几个大豆品种。鉴于其具有体细胞胚诱导能力，胚增殖能力，恢复整个植株的能力等优点，Jack已被确认为一个进行大豆遗传转化的主要基因型，并已专门用于产生转基因大豆 [49-51]，因此组织培养体系的优化只需要克服基因型的影响 [52-53]。这样的限制导致我们不能在特定的品种中进行转基因功能分析和品种改良。体细胞胚胎再生是一种可以通过杂交育种改善的遗传性状 [54]，体细胞胚胎再生能力成功的转移并结合在其他基因型上 [55-56]。

转化的物理过程往往会导致大的复合物、碎片和重组目的基因的整合，这有时会导致目的基因或同源的内源基因的沉默 [57-59]和DsRed2基因作为报告基因可以帮助减少相关物理问题改造的基因沉默与系统和促进目的基因的在转基因植物中稳定表达 [57, 60]。如水稻遗传转化结果中所示，线性转基因构造缺乏载体骨干序列也可能产生简单的整合拷贝数低转基因大豆植株[61]。

大豆体细胞胚作为合子胚模型已经吸引了更多的关注。增殖体细胞胚胎可以保留一年多的分化和发育再生特性，当它需要时比较容易诱导 [44, 47]。成熟的体细胞胚积累的贮藏蛋白与种子发育在时间和空降上相同 [62-63]，其脂肪酸组成也和种子相似 [64-65]。通常在带有外缘基因的粒子轰击体细胞胚7天后可以获得转基因胚胎，转基因胚胎的同质群体可随时和重复诱导分化 [66]。因此，在再生为植株前体细胞胚已经被用于评估转基因种子性状，然后筛选克隆让其成为转基因植株 [67-71]。

正如前面提到的体细胞胚粒子轰击介导转化体系的改进使整个实验时的广泛重现性好，但是仍有一定的局限性 [56-57, 66, 72-81]。2008年，日本RIKEN研究所植物科学中心支持转化网络联盟，以加强日本植物生物学的基础和应用研究；日本的学术研究人员的要求下，根据合作研究协议，在北海道地区的国家农业研究中心的工作人员将创建粒子轰击介导转化的转基因大豆 [84]。

3　聚乙二烯（PEG）

PEG介导的遗传转化是Davay等在1980年首先建立的。PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸（PLO）、磷酸钙以及高pH条件下诱导原生质体摄取外缘DNA分子，其中聚乙二醇、聚乙烯醇（PVA）和多聚L-鸟氨酸等都是细胞融合剂。PEG可以是细胞膜之间或是DNA与膜形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，另外，有实验证明，PEG是通过引起膜表面的电荷紊乱，干扰细胞间的识别，有利于细胞膜间的融合和外源DNA进入原生质体，因此称之为PEG诱导法 [2, 83]。PEG直接转化法对禾本科作物有重要的作用，已经在水稻、高粱和小麦等重要粮食作物都获得了转基因植株 [84]。PEG在大豆上的应用，目前仅有卫志明和南相阳两例报道 [85-86]。

4　电激法

电激法是利用植物原生质体具有整合和表达外源DNA的能力，是细胞膜透性在高压脉冲处理下发生变化，出现一颗可逆性空隙，促进外源DNA的摄取和整合，并可以稳定遗传。李宝剑等人首次将其用于植物细胞的遗传转化，并获得了转基因植株。用电激法转化大豆的报道并不多见。Christou等和Lin等均于1987年最先报道了电激法在大豆遗传转化上的应用，他们分别以合子胚和子叶分离的原生质体为外植体，他们都成功地导入了基因，但是并没有获得再生植株 [87-88]。Chowrira等对活体芽进行点击，得到了带有标记基因的转基因植株 [89-90]。

5　显微注射

显微注射法进行基因转化是一种比较经典的技术，其理论和技术方面的研究都比较成熟。特别是在动物细胞或卵细胞的遗传转化、核移植及细胞器的移植等方面应用很多。近年来，这项技术以培养细胞或胚性细胞团为受体 [91]。在大豆遗传转化方面，其是利用专门的仪器将目的基因或载体注入大豆的合子期子房或豆荚。1989年，刘博林等 [92]翔冬龙葵阿特拉津抗性psbA基因在合子期时注入对阿特拉津敏感的大豆子房中，得到了频率很高的psbA基因在大豆叶绿体基因组上的表达；同年，Chee等 [93]在大豆无菌苗的腋芽区域注射农杆菌进行转化，得到的转化频率较低的大豆转基因植株。2000年张燕君等 [94]将牛酪蛋白基因CaseinB用注射法导入大豆受精子房中获得转基因植株。2009年刘建凤 [95]将耐盐基因AIHX1通过子房滴注入大豆子房中，获得转基因植株，转化效率达到3.18%。

6　花粉管通道

花粉管通道技术是利用花粉管通道导入外源DNA的技术，他是由我国生物化学家周光召首先建立的，但是其机制尚不明确。在我国首批批准释放的大田转基因作物中，中国农科院培育的具有Bt杀虫蛋白基因和豇豆胰蛋白酶抑制基因的双价抗虫转基因棉花正是利用花粉管通道法获得的 [96]，由此可以证明花粉管通道法是可以应用于基因表达载体和总DNA等多种形态的遗传物质的转化。

因其具有，操作简单，育种时间缩短，外源DNA来源丰富等优点，在植株遗传转化和作物育种上有重要的应用价值。雷勃钧等 [97]用花粉管通道技术，将外源DNA直接导入栽培大豆，转化后代表现出在熟期、种皮颜色、蛋白质含量等方面的变异。刘德璞等 [98]在大豆自花授粉后，使用同一技术向栽培大豆导入外源DNA，获得了生育期、生长习性、株高、节数、分枝等倾向供体的变异性状，对SMV的抗性也得到了提高。2001年吴秀红 [99]报道了大豆花粉管通道法导入外源DNA后，在后代中发现外源基因在大豆细胞内存在、并表现多种变异性状。2009年高晓蓉 [100]利用花粉管通道技术转化植酸酶基因，获得转基因植株，转化效率达到13%。

7　展望

近些年来大豆的转基因技术取得了较大的进展，大豆转基因已不是限制大豆功能基因组学研究的主要因素，随着大豆基因组计划的完成也有大批重要农艺性状的基因被克隆，这样会促进大豆基因工程的全面展开，从而不再局限于抗虫、抗除草剂等研究，真正从分子水平有针对性的改良大豆的品质，人类也必将因此更加受益。