郭延生,贾启鹏,陶金忠

(宁夏大学农学院 动物科学系，银川 730020)

基于GC-MS策略的奶牛热应激血液代谢组学研究

郭延生,贾启鹏,陶金忠*

(宁夏大学农学院 动物科学系，银川 730020)

为了系统揭示热应激对奶牛血液代谢物及其代谢通路的影响。本研究根据奶牛热应激的判定标准，选择10头处于热应激状态的荷斯坦高产泌乳牛为热应激组，至次日凌晨直肠温度和呼吸频率恢复到正常范围时，再次被视为恢复组。各组奶牛尾静脉采血，制备血浆。然后采用GC-MS代谢组学技术，结合模式识别策略寻找两组奶牛血液差异代谢物，并将差异代谢物输入KEGG数据库进行代谢通路的构建与功能分析。结果表明，8个内源性代谢物可作为奶牛热应激的潜在生物标志物。其中，葡萄糖、α-亚麻酸、亚油酸、甘油、棕榈酸、β-羟丁酸和甘氨胆酸盐含量在热应激过程中显著降低，而乳酸含量显著升高。提示热应激加剧了奶牛能量负平衡状态，主要通过增强脂肪酸氧化和甘油分解代谢途径活性，抑制糖酵解过程进行调节和应答，在此过程中伴有肝功能障碍的生理现象。研究结果可为进一步阐明奶牛热应激的生理机制提供科学依据。

热应激；奶牛；代谢组学；GC-MS；血液代谢物

奶牛热应激是指奶牛受到超过本身体温调节能力的过高温度刺激时,引起机体发生的一系列异常反应。为了适应热应激，奶牛开始动用物理、生化和生理过程进行调节，以维持热平衡和正常体温。高产泌乳牛处于能量负平衡状态，而热应激时奶牛为了降低体内代谢热，本能的减少干物质采食量[1-2]，进一步加剧了高产泌乳牛的能量负平衡[3]。大量研究表明，热应激时奶牛产奶量和繁殖性能显著降低与其血液代谢物变化和能量负平衡密切相关[4-9]。因此检测血液内源性小分子物质代谢轮廓的变化有助于进一步揭示热应激引起奶牛泌乳性能和繁殖性能下降的生理机制。但目前研究仅局限于对血液中某些有限的生理指标的检测，并且这些生理指标来自不同的试验和报道，缺乏整体系统的检测方法研究热应激奶牛血液生理指标的代谢轮廓。代谢组学技术已应用于多种疾病生物标志物的挖掘和筛选中，它以生物体内小分子物质的动态规律变化来表征生物体的生理病理变化趋势，最终通过还原相关联生物事件提示生物体的病理生理变化实质和机制所在，其高通量的特性可以使体内同时出现的多个生理指标相互关联起来。

本研究采用GC-MS代谢组学技术，结合模式识别方法研究热应激对泌乳奶牛血液内源性代谢物的变化，以进一步阐明奶牛热应激的生理机制。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

美国安捷伦 6890N/5973N型GC-MS气质联用仪，梅特勒AL104电子分析天平，美国BECKMAN 公司OPTIME L-80 低温高速离心机 。

吡啶、乙腈、二十二烷、正庚烷等均为分析纯(北京北化康泰临床试剂有限公司)；甲氧胺盐酸盐、N-甲基-三甲基硅烷-三氟乙酰胺(MSTFA)：三甲基-氯硅烷(TMCS) =100∶1(瑞士 Fluka公司)。

1.2 试验动物和样品采集

试验奶牛来自宁夏某私人养殖场，在当地气候最炎热的月份(8月)，连续检测该场的圈舍温度和湿度，以湿温指数作为评价该场奶牛是否出现热应激的条件。根据奶牛热应激的判定标准，当圈舍湿度指数大于72时，奶牛处于热应激状态。据此标准10头2～3胎，泌乳60～90 d的荷斯坦高产泌乳母牛被选为热应激组，检查试验牛直肠温度均高于39 ℃，呼吸频率在90～120 次·min-1。用含肝素的采血管于尾静脉采血，3 000 r·min-1，4 ℃离心分离10 min制备血浆，编号1～10，于-80 ℃冰箱保存。次日06：00上述奶牛直肠温度和呼吸频率恢复到正常范围，被再次视为恢复组采集血样，用同样方法制备血浆并保存，编号11～20。

1.3 血浆样品的衍生化

将血浆样品从-80 ℃取出，在室温条件下解冻，取其解冻后的样品100 μL放入离心管中，加入乙腈250 μL以除去蛋白；在冰浴冷却的条件下超声10 min，4 ℃离心机中以10 000 r·min-1离心分离10 min，离心后的样品取其上清液于1.5 mL离心管中；将上清液放入40 ℃条件下的真空干燥箱中使其挥发至干；取出干燥的离心管，加入15 mg·mL-1甲氧胺吡啶溶液50 μL使其充分混匀，再在70 ℃条件下肟化1 h，加入MSTFA：TMCS=100∶1硅烷化试剂50 μL，进行衍生化处理，充分混匀后静置1 h，而后加入含有二十二烷的正庚烷(内标，0.1 mg·mL-1)150 μL，使其充分混匀，于4 ℃ 10 000 r·min-1离心10 min[10]，然后移取全部上清液于微量进样管中，以备GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析

GC-MS分析条件：进样量1 μL，初始温度为85 ℃，保持5 min，程序升温以10 ℃·min-1的速度上升至280 ℃，保持10 min；进样口温度：270 ℃；接口温度：270 ℃；离子源(EI)温度：230 ℃；电离电压：70 eV；四极杆温度：150 ℃；载气(高纯氦气)：流速1.0 mL·min-1；扫描方式：全扫描60～600 m·z-1。色谱柱：OV-1701[11]。

1.5 代谢组学数据分析

从Aglient 6890N/5973N 型GC-MS气质联用仪 Chemstation 采集的信号和质谱数据以ASCII的文件的格式(*.csv)输出，导出的原始数据采用Matlab7.0软件对每一个峰进行校准并积分，积分后峰匹配后得到峰表，峰表由化学成分的保留时间和相应的峰面积组成。用内标法计算不同组样品的峰组成的相对含量。得到变量的峰表。此峰表包括了一些缺失值，根据S.Bijlsma等[12]报道的缺失值处理方法，采用修正80%的原则来去除缺失值，即去除某一组中出现频率低于80%的代谢物，得到一个由代谢物的相对峰面积和保留时间组成的二维数据矩阵。此矩阵被导入SIMCA-P 12.0软件(瑞典Umetrics AB公司)中的主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法判别分析法(PLS-DA)进行模式识别分析，筛选差异代谢物，作为奶牛热应激的潜在生物标志物。

1.6 生物标志物的鉴定及代谢通路分析

根据生物标志物的质谱碎片(RI)，主要通过比较仪器自带的美国国家标准与技术局化学数据库(National Institute of Standards and Technology，NIST)图书馆物中的质谱信息，进行生物标志物的鉴定和推测。如果质谱碎片在NIST图书馆中不匹配，再将RI与 Metabolome Database (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/gmd.html)和Metabolome 数据库(http://www.hmdb.ca/) 进行比较，最终确定其结构。为进一步识别和可视化热应激对奶牛血液代谢途径的影响，将鉴定后的生物标志物输入KEGG数据库(http://www.kegg.com)，选择Bostaurus(cow通路)为通路路径库，进行代谢通路的构建与分析。

2 结 果

2.1 奶牛血液代谢物的GC-MS分析

按1.4方法建立了热应激奶牛血液GC-MS指纹图谱，其总离子流图见图1。导出的原始数据采用Matlab7.0软件进行数据预处理后得到一个20样本×95变量的峰表，此表是由相对峰面积和保留时间组成的二位数据矩阵。

1～20.血浆编号：1～10.热应激组；11～20.恢复组1-20.The plasm sample code：1-10.Heat stress dairy cows；11-20.Recovery dairy cows图1 奶牛血浆GC-MS总离子流图Fig.1 Total ion current (TIC) chromatograms for the GC-MS metabonomic analysis in dairy cows plasma

2.2 模式识别和差异代谢物的筛选

将所得二位数据矩阵导入SIMCA-P 12.0软件进行模式识别，首先采用非监督类的模式识别方法PCA对奶牛血液 GC-MS代谢指纹峰的内在相似性进行识别，在PCA得分图中，每个点代表一个独立的样品。从图2A可以看出，血液样品7和10位于95%置信区间外，从数据矩阵中发现这两个样品的内标峰面积极显著低于其他样品的峰面积，推测可能由于样品衍生化过程中的试验误差所致。过低的内标峰面积会影响相对峰面积的值。因此样品7和10被排除后进一步进行PCA分析，新的PCA散点图(图2B)显示剩余的18个样品均在95%置信区间。

在PCA模型基础上，采用PLS-DA模型进一步分析热应激对奶牛血液代谢模式的影响，继而筛选差异代谢物。从PLS-DA模型3D得分散点图(图3)可以看出，根据相对峰面积，热应激组与恢复组被明显区分开，18个样品均在95%的置信区间。PLS-DA载荷图代表了变量对分类的影响，距中心越远，表明变量具有更高的VIP值(Variable importance in the projection)，VIP值大于1.0的变量被视为对分类具有重要意义的变量。根据变量载荷图和VIP值(图4)，VIP值大于1.0的8个代谢物被选为奶牛热应激的差异代谢物或潜在生物标志物(表1)。

A.20个样品；B.18个样品A.The PCA model of 20 samples；B.The PCA model of 18 samples图2 奶牛血浆PCA 得分散点图Fig.2 PCA score plots of dairy cows plasma

图3 奶牛血浆PLS-DA 3D得分散点图Fig.3 PLS-DA 3D score plots of dairy cow plasma

2.3 生物标志物的鉴定和代谢通路分析

根据NIST，8个奶牛热应激生物标志物的结构被确认(表1)，各生物标志物衍生化后的质谱碎片(RI)见图5所示。其中恢复组葡萄糖、α-亚麻酸、亚油酸、甘油、棕榈酸、β-羟丁酸和甘氨胆酸盐含量较热应激组明显降低(P<0.05)，而乳酸含量明显升高(P<0.01)(表1)。为了进一步解释热应激对奶牛生理机制的影响，8个生物标志物被输入KEGG数据库进行了代谢通路分析，结果显示，热应激过程中，糖酵解途径被抑制，而能量代谢、脂肪酸氧化、甘油分解代谢增强，并且伴有肝功能障碍的生理现象。

3 讨 论

泌乳牛处于能量负平衡的生理状态，据报道，热应激时奶牛能量消耗增加，血糖浓度降低[13-14]。本研究采用GC-MS代谢组学技术也证实恢复组奶牛血糖浓度低于热应激组，即奶牛在应激过程中血糖浓度呈降低趋势，说明葡萄糖氧化途径活性增强，以提供更多的能量弥补热应激所致的能量过度消耗。这在一定程度上加剧了奶牛能量负平衡状态。

研究结果进一步表明，恢复组α-亚麻酸、亚油酸、棕榈酸和β-羟丁酸的含量低于热应激组，这与L.Calamari等的报道相一致[14]，说明应激奶牛自身通过增强脂肪酸β-氧化活性，释放更多的能量来弥补应激所致的能量过度消耗。已知甘油代谢与糖代谢关系十分密切，血中的甘油被运送至肝组织，主要在甘油激酶的催化下转变成3-磷酸甘油，然后脱氢生成磷酸二羟丙酮，后者循糖的分解途径进一步代谢或者进入糖的异生途径转变为葡萄糖或糖原。本研究结果显示，恢复组奶牛血液中甘油的含量低于应激组，说明热应激时甘油分解代谢途径活性增强，这同样有利于弥补应激所致的能量不足。

目前尚无热应激时奶牛血中乳酸含量变化的相关报道。本研究采用GC-MS代谢组学技术发现，应激组奶牛血中乳酸含量低于恢复组，表明在应激过程中糖酵解途径的活性被抑制，这与应激时脂肪酸β-氧化活性增强可相互印证，因为早期的研究已经证实，脂肪酸β-氧化活性增强，细胞中柠檬酸的浓度升高，柠檬酸可通过抑制磷酸果糖激酶以减慢糖酵解途径的活性过程。另据报道，热应激时由于碳酸氢盐的变化致使奶牛血液pH呈现从碱中毒到酸中毒的昼夜节律性变化，并且在气温凉爽的晚上表现出代谢性酸中毒的状态[15]。本研究中热应激时乳酸含量的变化也呈现出这种昼夜规律性的变化趋势。乳酸因其强酸性对血液pH也有较大的影响，因此推测，热应激时奶牛血液pH昼夜节律性变化不仅与过度呼吸所致的碳酸氢盐的浓度有关，同时也与乳酸含量变化有关。

表1 热应激组与恢复组生物标志物含量比较(平均值±SD)

Tables 1 Comparison of biomarker contents between heat stress and recovery cows (mean±SD)

代谢物Metabolite保留时间/minRetentiontimeVIP值VIPvalue热应激组(n=8)Heatstressgroup恢复组(n=10)Recoverygroupα⁃亚麻酸Alpha⁃Linolenicacid18．062．210．088±0．0180．059±0．026∗亚油酸Linoleicacid23．711．640．009±0．0070．005±0．003∗乳酸Lactate12．481．502．465±0．6898．889±0．558∗∗D⁃葡萄糖D⁃glucose24．081．380．193±0．0550．151±0．084∗甘油Glycerol15．511．150．732±0．1850．673±0．208∗棕榈酸Hexadecanoicacid28．011．090．401±0．1950．337±0．193∗甘氨胆酸盐Glycocholate21．901．480．009±0．0030．007±0．003∗β⁃羟丁酸β⁃Hydroxybutanoate14．981．300．017±0．0130．009±0．005∗∗

Compared with heat stress cows：*.P<0.05，**.P<0.01

图4 奶牛血浆PLS-DA载荷图(A)和VIP(B)Fig.4 Loading plot (A) and VIP plot (B) of PLS-DA for dairy cow plasma

A.α-亚麻酸；B.亚油酸；C.乳酸；D.D-葡萄糖；E.甘油；F.棕榈酸；G.甘氨胆酸盐；H.β-羟丁酸A.Alpha-Linolenic acid；B.Linoleic acid；C.Lactate；D.D-glucose；E.Glycerol；F.Hexadecanoic acid；G.Glycocholate；H.β-Hydroxybutanoate图5 热应激生物标志物衍生物的GC-MS质谱图Fig.5 Mass spectra of derivative of heat stress biomakers

众所周知，胆汁酸在肝中由胆固醇转化生成，然后排入肠腔，大约95%的胆汁酸被重吸收后经门静脉返回肝，仅有少部分进入血液循环。因此血液胆汁酸的浓度高低取决于肝功能的状态，当肝损伤时血中胆汁酸浓度极易升高。甘氨胆酸盐是胆汁酸的主要成分，因此血中甘氨胆酸盐是目前公认的反映肝损伤的最敏感指标。本研究结果显示，热应激组奶牛血中甘氨胆酸盐的含量高于恢复组奶牛，说明热应激有可能引起肝功能障碍，尽管在本试验中甘氨胆酸盐的升高仅仅是生理性升高。据报道，热应激可导致奶牛抗氧化能力下降[16-18]，因此可以推测甘氨胆酸盐含量升高可能与热应激时抗氧化能力下降，肝组织脂质过氧化有关。

4 结 论

本研究采用GC-MS代谢组学方法研究了热应激对奶牛血液内源性小分子物质代谢的影响，8个代谢物被确定为热应激潜在的生物标志物，结构鉴定确认为葡萄糖、α-亚麻酸、亚油酸、甘油、棕榈酸、β-羟丁酸、甘氨胆酸盐和乳酸。代谢通路分析显示，热应激加剧了泌乳牛能量负平衡的状态，主要通过增强脂肪酸氧化和甘油分解代谢途径的活性，抑制糖酵解过程来缓解应激时能量负平衡的生理状态，在此过程中伴有肝功能障碍的生理现象。研究结果对进一步阐明奶牛热应激的生理机制具有重要的科学意义。

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(编辑 郭云雁)

Blood Metabolomic Studies of Heat Stress Cow with GC-MS

GUO Yan-sheng，JIA Qi-peng，TAO Jin-zhong*

(DepartmentofAnimalScience，SchoolofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan730020，China)

The study aimed to reveal the effects of heat stress on dairy cow blood metabolites and its metabolic pathways in a systematic way.According to the criteria for evaluating cow heat stress，10 high milk yield Holstein cows in heat stress status were selected as heat stress group，these cows were regarded as recovery group again until their rectal temperature and respiratory rate returned to the normal range at next morning.Blood samples of each group were collected via tail vein and the plasm were separated.And then we developed and applied a gas chromatography-mass spectrometry GC-MS metabolomics protocol combined with pattern recognition approaches to search differential metabolites between the heat stress and recovery groups，and the differential metabolites were analyzed by KEGG for reconstructing the metabolic pathway and functional analysis.8 metabolites were selected as heat stress potential biomakers and indentified.These biomarkers included alpha-linolenic acid，linoleic acid，lactate，D-glucose，glycerol，hexadecanoic acid，glycocholate and β-Hydroxybutanoate.The content of lactate in heat stress status increased，the other metabolites decreased.Functional pathway analysis revealed that heat stress aggravated the state of energy negative balance in cow，and the lactating dairy cow blood metabolically responded to heat stress through increasing β-oxidation of fatty acid and glycerol metabolic and decreasing in glycolosis activity accompanied with liver dysfuction.The study may provide a strong evidence for further researching the physiological mechanism of heat stress cow.

heat stress；dariy cows；metabonomics；GC-MS；blood metabolites

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.011

2014-11-12

宁夏自然科学基金(NZ12151)

郭延生(1978-)，男，甘肃庄浪人，博士，副教授，主要从事临床兽医学研究，E-mail：guoyansheng1978@163.com

*通信作者：陶金忠，副教授，E-mail:tao_jz@nxu.edu.cn

S815.4

A

0366-6964(2015)08-1356-07