赵传慧，周厚君，童再康，林二培，黄华宏，牛明月

光皮桦成花相关MADS-box基因BlMADS1的克隆与表达

赵传慧，周厚君，童再康，林二培，黄华宏，牛明月

（浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300）

MADS-box家族基因广泛分布于植物中，在花发育过程中起着重要调控作用。采用同源克隆结合cDNA末端快速扩增技术（RACE）在光皮桦Betula luminifera中克隆到1个MADS-box基因，命名为BlMADS1。该基因可能存在2个不同的转录本BlMADS1S和BlMADS1L：前者为1 150 bp，编码254个氨基酸，具有MADS-box基因的典型结构，与欧洲白桦Betula pendula的同源基因相似性最高（97%）；后者长1 312 bp，但仅含有690 bp的开放阅读框（ORF），编码229个氨基酸，缺失MADS-box蛋白的C端。这种缺失可能由内含子可变剪切造成。同源比对和系统进化分析表明：BlMADS1属于AP1/SQUA亚家族的AGL79这一分支。定量聚合酶链式反应（PCR）表达分析表明：BlMADS1基因在根、茎、叶和花器官中均有表达，但BlMADS1S和BlMADS1L这2个转录本表达模式存在差异。雄花序发育过程中，BlMADS1的2个转录本的表达峰值均在萌动雄花序时期；而在雌花序发育过程中，BlMADS1L 和BlMADS1S表达水平的峰值分别出现在初生雌花芽和萌动雌花序。图6表1参27

林木育种学；光皮桦；开花； MADS-box；表达分析

MADS-box基因是一类数目庞大、高度保守并广泛分布的基因家族，在植物、动物、酵母等真核生物中都发现了该类基因的存在［1］。植物MADS-box基因均编码转录因子，除了主要参与花、果实等生殖发育的调控外，还对根、叶等营养器官的发育起着重要作用［2－7］。在高等植物中，MADS-box基因编码蛋白是由高度保守的MADS-box域（M域），较为保守的K域，相对保守的I域和多变的C域组成，属于MIKC型［8－10］。MADS-box基因及其功能的研究大多集中在拟南芥Arabidopsis thaliana和金鱼草Antirrhinum majus等草本模式植中，在林木中的研究较少。目前，仅有杨树Populus trichocarpa，欧洲白桦Betula pendula，苹果Malus domestica等少数几个树种上有相关报道。例如，在欧洲白桦存在3个AP1/ SQUA-like基因BpMADS3，BpMADS4及BpMADS5，它们在雄花序和雌花序发育过程中大量表达；转基因表明BpMADS4基因能促进苹果开花［11］，还有助于延缓杨树衰老和休眠，BpMADS4基因不仅在花序发育起始阶段发挥重要作用，还参与营养生长向生殖发育的转变［12］。光皮桦Betula luminifera，属桦木科Betulaceae桦木属Betula落叶乔木，是一种用途广泛的珍贵阔叶用材树种［13］。光皮桦材质优良，经济价值高，多数种质童期较短（1.5 a），种内具有丰富变异，是优良的林木遗传研究材料。近年来，光皮桦的遗传改良工作逐渐受到重视［14－16］。然而，对于光皮桦开花相关基因的功能及其调控机制研究甚少。本研究以光皮桦无性系植株为材料，克隆光皮桦开花相关基因BlMADS1，分析其序列特征。通过分析BlMADS1在光皮桦不同器官及不同发育时期花器官中的表达特性，初步明确了BlMADS1与光皮桦成花间的相关性。这些研究结果为利用分子生物学手段调控光皮桦开花，促进其营养生长，提高木材产量奠定了一定的基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以浙江农林大学林木良种繁育中心的光皮桦无性系苗（6年生）为试验材料，1月中旬至3月底按照叶和雌花序、雄花序等器官的不同发育阶段分别取材：幼叶（L1），嫩叶（L2），成熟叶（L3）；萌动雌花芽（FB1），初生雌花芽（FB2），初生雌花序（FI1），发育雌花序（FI2），成熟雌花序（FI3）；休眠雄花序（MI1），萌动雄花序（MI2），成熟雄花序（MI3）。－80℃保存备用。

1.2 总核糖核酸（RNA）的提取与cDNA合成

植物材料经液氮预冻后研磨，以PureLinkTMPlant RNA Reagent（Invitrogen）试剂盒提取总RNA，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒（Clontech）反转录合成cDNA，用于基因克隆和表达分析。

1.3 基因克隆

鉴于光皮桦和欧洲白桦的亲缘关系和MADS-box基因的保守性，根据欧洲白桦MADS-box家族AP1/ SQUA-like基因（Genbank号为X99653，X99654，X99655）的MADS区，设计引物MADS-GSP2进行3′-RACE。根据获得的3′-RACE产物序列设计引物MADS-GSP1进行5′-RACE扩增基因的5′端序列。将cDNA末端快速扩增技术（RACE）获得的序列进行拼接，在5′和3′非编码区位置，设计特异引物M1-F和M1-R，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增基因全长序列。根据MADS-box基因的结构，设计特异引物MGF和MG-R，克隆BlMADS1基因3′端部分序列，以验证其可变剪切是否存在。克隆涉及引物列于表1。RACE采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech），具体的操作过程按照试剂盒说明书进行。全长克隆采用Hifi-taq（TransGen Biotech），聚合酶链式反应（PCR）按照试剂说明书进行。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶回收试剂盒（Axygen）进行回收，回收产物连接到载体pMD19-T载体，转化进入E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆由南京金斯瑞公司进行序列测定。

1.4 序列分析

采用Vector NTI 11.0（Invitrogen）进行序列拼接和多序列比对。利用Nucleic Tools（http://srs.ebi.ac.uk/ srsbin/cgi-bin/wgetz-page+applSelect）分析推测基因编码蛋白的氨基酸组成。利用蛋白质保守结构域推测工具InterProScan（http://ebi.ac.uk/Tools./InterProScan/）分析其结构域。基于拟南芥，水稻Oryza sativa，杨树，番茄Solanum lycopersicum的AP1/SQUA-like MADS-box蛋白中MIK区氨基酸序列，采用MEGA 4.0软件（邻接法）进行多序列比较，对光皮桦BlMADS1进行系统进化分析［17］，所用序列来自数据库NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov）。具体的基因名和序列号参考Shan等［18］的报道。

1.5 实时定量PCR

以光皮桦Actin基因（Genbank号为FJ410442）为内参，采用相对定量的方法，对BlMADS1基因2个转录本的组织表达特性及其在不同器官发育过程中的表达规律进行分析。按照SYBR Premix Ex Taq II （TaKaRa）说明书进行定量PCR操作，扩增反应程序为95℃3 min；95℃5 s，60℃10 s，40个循环。内参基因Actin的引物为Actin-Q-F和Actin-Q-R，BlMADS1L的引物为M1-Q-F和M1-Q-R，BlMADS1S的引物为M1-Q-F和M1-Q-R2（表1）。重复3次·试验-1。

表1 用于基因克隆和表达分析的引物Table 1 Primers used for cloning and expression analysis

2 结果与分析

2.1 BlMADS1基因的克隆与序列分析

根据高度保守的MADS区设计简并引物（MADS-GSP2），用于光皮桦MADS基因3′端序列的分离。以光皮桦茎、叶、花序和根等混合组织的cDNA为模板，进行3′-RACE获得2个约1 kb的片段，克隆测序表明这2个序列分别长1 099 bp和937 bp，这2个片段仅在靠近3′端的编码区存在差异，且差异序列具有典型的内含子特征（GT-AG）（图 1和图2A）。根据所得 3′端序列设计特异引物（MADSGSP1）进行5′-RACE，获得长约500 bp的片段（图1），测序拼接获得长1 284 bp和1 104 bp的2条序列（图 2）。根据这些序列，在序列2端设计特异引物M1-F1和M1-R1扩增到包含完整开放阅读框（ORF）在内的序列，获得了预期大小的2个片段（图1），BLAST结果也显示这2条序列为MADS-Box基因。这表明在光皮桦中该基因存在2个不同的转录本，因此将该基因命名为BlMADS1，并将其2个不同的转录本分别命名为BlMADS1L（长转录本）和BlMADS1S（短转录本）。为了验证BlMADS1L中3′端多余的序列是否为内含子，在基因组中是否存在，在这2个转录本差异区域的2端设计引物（MG-F和MG-R），以光皮桦基因组DNA为模板克隆其对应的基因组序列。结果表明：PCR扩增得到的基因组片段和BlMADS1L转录本对应片段的序列一致。这说明BlMADS1基因2个转录本间序列的差异可能是由内含子的可变剪切引起的（图2B）。

图1 BlMADS1基因PCR产物电泳分析Figure 1 Electrophoresis of PCR products for BlMADS1

图2 BlMADS1的2个转录本序列分析Figure 2 Sequence alignment for two transcripts of BlMADS1

2.2 BlMADS1编码蛋白分析

序列分析表明：BlMADS1S包含 1个 765 bp的开放阅读框（ORF），编码 254个氨基酸；而BlMADS1L由于含有未剪切的内含子，造成提前终止，仅包含1个690 bp的ORF，编码229个氨基酸。同源序列比对显示BlMADS1S/L与欧洲白桦Betula pendula MADS4蛋白相似性最高，分别达97%和85%，而与拟南芥AP1蛋白的相似性则分别为68%和67%（图3）。 进一步的序列比对表明这2个蛋白均具有典型的MADS-box和K-domain，BlMADS1S编码的蛋白在C末端具有AP1/SQUA-like MADS-box基因亚家族的特征性paleoAP1 motif，而BlMADS1L编码的蛋白由于序列提前终止而造成paleoAP1 motif的缺失（图3）。这些结果表明：光皮桦BlMADS1基因属于AP1/SQUA亚家族，且可变剪切造成的2个不同转录本编码不同的蛋白。

2.3 BlMADS1的系统进化分析

已有的研究表明真双子叶植物AP1/SQUA-like MADS-box在进化中经历了 2次倍增事件（duplication），形成了euAP1，euFUL和AGL79这3个主要分支［15］。为了分析 BlMADS1与其同源基因的进化关系，选取来自金鱼草、拟南芥、欧洲白桦等植物的AP1/SQUA-like同源基因进行系统进化分析。分析结果显示：光皮桦BlMADS1属于 AP1/SQUA-like亚家族AGL79分支，其与同属的欧洲白桦BlMADS4亲缘最近，其次是切花菊Chrysanthemum grandiflorum的CDM41，而与拟南芥的AGL79亲缘较远（图4）。

图3 BlMADS1同源比对和序列分析Figure 3 Sequence alignment and analysis of BlMADS1

2.4 BlMADS1基因的表达分析

本研究采用光皮桦Actin基因作为内参，对BlMADS1基因2个转录本的组织表达特性及其在光皮桦不同发育阶段的雄花序、雌花序和叶片（图5）中的表达规律进行了分析，结果如图6所示。BlMADS1在所有检测组织中均有表达，但2个转录本有不同的表达模式。BlMADS1L在雌花芽（FB）和雄花序（MI）中表达量较高，在根中的表达量最低；BlMADS1S在雌雄花序中表达量较高，在茎中表达量最低（图6A）；在不同发育阶段的花序和叶片中，BlMDAS1L在初生的雌花芽（FB2）中表达量最高，而在其他阶段的雌花序中表达量极低，在雄花序中则主要在萌动雄花序（MI-2）中表达，在成熟的雄花序中几乎不表达；而BlMADS1S的表达高峰分别出现在萌动雄花序（MI-2）和发育的雌花序（FI-2）（图6B）；此外，BlMADS1在不同发育状态的叶片中的表达差异不明显（图6B）。这些结果说明：BlMADS1基因在光皮桦雌雄花序萌动成熟的过程中起主要调控作用，并且还可能与光皮桦雌花序发育的启动相关。

3 讨论

MADS-box基因家族是植物中较大的基因家族，序列上具有保守性，结构上也有一定的相似性，但在不同物种甚至不同的组织器官之间，MADS-box基因在功能上存在着很大的差异［19］。目前，虽然在多种植物中均发现了MADS-box转录因子，如在拟南芥中存在100多个MADS-box基因，除少数几个MADS-box基因已研究表明在拟南芥花发育中发挥着重要作用，还有超过80%的MADS-box基因功能是未知的［20］。同样地，在多数林木中，MADS-box基因的功能仍不明确，其与林木成花或其他发育过程的相关性也有待进一步研究。

本研究以童期较短的用材树种光皮桦为材料，采用同源克隆和RACE的方法从光皮桦中克隆得到了1个MADS-box基因，命名为BlMADS1。序列分析的结果表明：BlMADS1基因属于AP1/SQUA亚家族，且该基因存在2个不同的转录本，可能是由于3′-端内含子的可变剪切造成的。BlMADS1基因的2个转录本均编码典型的MADS-box蛋白，具有保守的MADS-box和K-domain，而较长的转录本由于内含子的存在而提前出现终止子，使其编码的蛋白在C末端缺失其特征性的paleoAP1 motif。类似的可变剪切造成的C末端缺失在其他AP1/SQUA类MADS-box基因也有发现［15,21－22］。这暗示这种内含子的可变剪切可能是AP1/SQUA-like MADS-box基因调控的方式之一。

图4 光皮桦BlMADS1编码蛋白的系统进化分析Figure 4 Phylogentic analysis of BlMADS1 and related AP1/SQUA-like MADS-box genes

MADS-box基因家族在进化中经历了多次复杂事件，其中AP1/SUQA亚家族基因在真双子叶植物分化前经历了2次倍增事件，形成3个主要分支euAP1，AGL79和euFUL［23］。AGL79和euFUL类基因具有保守的paleoAP1基序（或结构域），被认为是比较原始的类型，但它们之间的进化关系仍不明确。系统分析结果表明BlMADS1属于AGL79这一分支，与同属的欧洲白桦BlMADS4亲缘最近，与切花菊CDM41聚为一类，其次与葡萄Vitis vinifera VFUL-L和金鱼草DEF28等具有较近的亲缘关系。同时BlMADS1也具有paleoAP1 motif，说明BlMADS1在进化上属于较原始的类型。另有研究表明：欧洲白桦BpMADS3，BpMADS4及BpMADS5基因分别是拟南芥AP1/CAL，AGL79及FUL基因的直系同源物［24］。光皮桦BlMADS1基因与欧洲白桦BpMADS4基因具有最近的亲缘关系，说明BlMADS1基因也是拟南芥AGL79基因的直系同源物。

在功能上，许多研究表明AP1/SQUA-like亚家族基因在花器官的起始、萼片及叶片的发育中发挥重要的调控功能［25－26］。如欧洲白桦BpMADS4基因在雌雄花序分生组织起始的早期阶段以及分生组织顶端部位、幼嫩苞片初始部位的表达水平较高，随着发育的进行，雄花序和苞片中的表达下降，而雌花序中，表达会持续至开花后，且种子形成阶段主要在胚珠中表达［27］。值得注意的是，可能由于可变剪切，在光皮桦中BlMADS1基因存在2个转录本，长转录本BlMADS1L编码缺失C末端的MADS-box蛋白，短转录本BlMADS1S则编码正常的MADS-box蛋白。以往的研究通常认为，这种可变剪切的转录本会通过降低正常转录本的浓度，或编码非正常蛋白，起到抑制正常转录本功能的作用［15］。本研究的表达分析表明，BlMADS1基因2个转录本在光皮桦雌雄花序发育过程中具有的不同表达模式。这2个转录本均在萌动雄花序中表达量最高，在休眠和成熟的雄花序中的表达水平则降低，这与欧洲白桦BpMADS4基因在雄花序中的表达模式较一致；在雌花序发育过程中，BlMADS1L的表达最高峰出现在孕育雌花序的花芽中，而BlMADS1S的表达峰值则出现在萌动发育中的雌花序中，这与BpMADS4基因在雌花序中的表达模式存在差异，暗示BlMADS1L可能在光皮桦雌花序发育启动中起抑制作用，而BlMADS1S则可能有促进光皮桦雌花序萌动成熟的功能。这些结果说明，光皮桦BlMADS1基因2个转录本的表达可能存在一种协同关系，这种协同作用可能在雌雄花序萌发成熟过程中起重要的调控作用。

图5 不同发育阶段的4种器官Figure 5 Different developing stages of four organs

图6 BlMADS1基因在不同器官和不同发育时期组织中的表达分析Figure 6 Expression analysis of BlMADS1 in different organs and tissues from different development stages

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Cloning and expression analysis of a floral related MADS-box gene BlMADS1 from Betula luminifera

ZHAO Chuanhui,ZHOU Houjun,TONG Zaikang,LIN Erpei,HUANG Huahong,NIU Mingyue
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A and F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

As a highly conserved transcription factor family in plants,MADS-box genes play important roles in floral development and regulation of other developmental processes.However,few floral related MADS-box genes have been characterized in Betula luminifera.In this study,a MADS-box gene,BlMADS1,was cloned from Betula luminifera by using homologous cloning and rapid amplification of cDNA ends （RACE）methods. Afterward expression analysis was also conducted.Results of the sequence analysis indicated that BlMADS1 probably had two different transcripts--one was 1 150 bp in length and contained a 765 bp open reading frame （ORF）encoding 254 amino acid residues.This protein was a typical MADS-box protein belonging to the AP1/ SQUA subfamily.The other transcript contained an insertion of 162 bp at the 3′-terminal.The ORF of this transcript was only 690 bp in length encoding 229 amino acid residues with a truncated C terminal,which may have been caused by intron’s alternative splicing.The expression analysis also indicated that BlMADS1 was expressed in all tissues,but showed different expression patterns on its two transcripts during inflorescence development.During male inflorescence development,the highest expression of both these two transcripts was detected in the germinating male inflorescence;whereas,during development of the female inflorescence,thehighest level of BlMADS1L was shown in the germinating female inflorescence buds and the highest level of BlMADS1S was found in the developing female inflorescence.Our study provides basic knowledge about MADS-box genes in Betula luminifera,and will be facilitate further investigation of BlMADS1’s function and regulation mechanism in future.［Ch,6 fig.1 tab.27 ref.］

forest tree breeding;Betula luminifera;flowering;MADS-box;expression analysis

S722.3

A

2095-0756（2015）02-0221-08

浙 江 农 林 大 学 学 报，2015，32（2）：221-228

Journal of Zhejiang A＆F University

10.11833/j.issn.2095-0756.2015.02.008

2014-02-20；

2014-03-18

浙江省自然科学基金资助项目（Y3110453）；浙江省农业科技重点项目（2011C12014）；浙江农林大学人才启动项目（2010FR064）；浙江省重点科技创新团队资助项目（2009R50035-9）

赵传慧，从事林木遗传育种研究。E-mail:671469086@qq.com。通信作者：童再康，教授，博士，博士生导师，从事林木遗传育种研究。E-mail:zktong@zafu.edu.cn