李成林 江会镇 陈博灵 卢健琪 潘朝锌 王庆高

湖北中医药大学(武汉 430000)

扶芳藤益心方对缺氧/复氧后人心内膜微血管内皮细胞的增殖作用

李成林 江会镇△陈博灵▲卢健琪▲潘朝锌▲王庆高▲

湖北中医药大学(武汉 430000)

目的：研究扶芳藤益心方对缺氧/复氧后人心内膜微血管内皮细胞(HUMCE)增殖的影响。方法：取体外培养的第4代HUMCE分为造模组：扶芳藤益心方组(FY)、益心方组(Y)、卡托普利高、中、低浓度组(10-2μmol/L、10-3μmol/L、10-4μmol/L)、对照组(H/R)和非造模组(N)。造模组行缺氧/复氧(H/R)处理，非造模组不做缺氧/复氧处理,两组均添加相应的含药血清干预培养24h后，通过MTT法测定各组OD值，流式细胞仪检测细胞Caspase-3阳性细胞数，酶联免疫法(ELISA)检测各组血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果：与造模组比较，非造模组OD值大(P<0.05)，VEGFR-2、VEGF含量与Caspase-3阳性细胞数均高于造模组(P<0.05)。与对照组比较，扶芳藤益心方组OD值高(P<0.05)；Caspase-3阳性细胞数升高9.87%(P<0.05)；VEGFR-2、VEGF浓度升高(P<0.05)。与扶芳藤益心方组比较，益心方组、卡托普利中、低剂量组OD值低，卡托普利高剂量组OD值高(P<0.05)；卡托普利低剂量组VEGFR-2、VEGF浓度低(P<0.05)，卡托普利高、中剂量组均高于扶芳藤益心方组(P<0.05)；益心方组、卡托普利中、低剂量组Caspase-3阳性细胞数分别较扶芳藤益心方组降低6.77%、2.49%、5.7%，卡托普利高剂量组升高4.39%(P<0.05)。结论：扶芳藤益心方可以提高内皮细胞在缺氧/复氧后的增殖活性，降低内皮细胞的凋亡率，优于益心方组、卡托普利低、中剂量组，且提高缺氧/复氧损伤后内皮细胞VEGFR-2、VEGF浓度，优于卡托普利低浓度组和益心方组，改善内皮功能。

血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor VEGF)是目前已知的作用最强的促血管生成因子。生理情况下，VEGF及其受体的表达水平均很低，只有在内皮细胞受损时才会有增殖效应。缺血缺氧是VEGF最强有力的调控因素。VEGFR主要分布于血管内皮细胞。缺氧对受体表达也起重要调节作用。Waltenberger发现，缺氧时人脐静脉内皮细胞中VEGFR-2水平上升,而VEGFR-2mRNA仍保持稳定甚至有所下降。研究发现，无论在生理还是在病理情况下，均能促进新生血管的形成，调节血管生成的大多数环节，包括内皮细胞外基质溶解、内皮细胞迁移、增生和管腔形成、增加细胞间黏附和血管细胞黏附分子水平及诱导内皮细胞上相应的配体和受体的表达等。血管内皮细胞的损伤是心血管性疾病的关键环节[1]，心脏缺血再灌注过程中最先波及的基本部位也是最关键的部位是心内膜微血管内皮细胞[2]，它是诸多毒素、病毒、炎症因子等的重要靶位，该部位的变化对各组织、器官的损伤和功能的恢复影响巨大[3-5]。壮医认为，心内膜微血管内皮细胞损害可归属于壮医“龙路病”范畴，人体气血虚弱的基础上，邪毒滞留龙路，使局部的“龙路”网络瘀阻不畅，终致道路不通、天地人三部之气不能同步运行、气血瘀滞而发病。治疗当以补虚、通龙路、祛瘀为大法。根据壮医组方理论，针对补虚、通路、祛瘀治法，需投以公药进行组方。笔者自拟以扶芳藤为君、人参和三七为臣、石菖蒲为佐使的扶芳藤益心方及去扶芳藤的益心方(以下简称益心方)，观察试验中对缺氧/复氧后人心内膜微血管内皮细胞的影响，现将研究结果报道如下。

1 材料和方法 1.1 试 剂 MTT试剂盒(Sigma公司)，卡托普利纯粉(上海远慕生物科技有限公司提供，批号：K0164)，VEGFR、VEGF试剂盒(武汉华美，批号：Y19012415，Y05012414)，一抗：Rabbit Anti-active-Caspase-3 antibody (ab4051)同型对照：兔IgG (碧云天A7016)，二抗：FITC标记的山羊抗兔二抗(ab6717)。

1.2 主要仪器与动物 酶标仪(BioTek公司)，Millpore Guava 6HT 流式细胞仪，Eppendorf冷冻离心机，紫外分光光度计(天津，型号：UV-1800)，SD大鼠，SPF级，180～220g，雌雄各半(广西医科大学动物实验中心)，原代人心内膜微血管内皮细胞、原代内皮细胞特制培养体系(武汉原生原代生物医药科技有限公司，HUM-CELL-0017，)，扶芳藤益心方醇提膏、益心方醇提膏(广西中医药大学制药厂提取，药材红参、三七、石菖蒲由南宁市景昌中药饮片有限公司提供，扶芳藤由广西中医药大学制药厂提供)。

1.3 制备含药血清 12只SD大鼠分为扶芳藤益心方组(FY)、益心方组(Y)和空白组，每组4只大鼠，雌雄各半。按所需浓度称取卡托普利纯粉溶解在大鼠血清中制备卡托普利药物血清。根据表1，配成药液，4℃保存。FY组、Y组大鼠以20mL/Kg药液浓度灌胃，空白组以20mL/Kg的蒸馏水灌胃，连续3d，1d2次。第3d最后1次给药1h后，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，室温静置2h后，3000r/min离心分离血清，56℃水浴灭活，0.22μm无菌滤器过滤除菌，-20℃保存备用。

表1 扶芳藤益心方及益心方药液配置

注：人用剂量这里扶芳藤益心方以临床日用剂量58g生药/人/次；益心方为28g生药/人/次

1.4 试验分组与H/R模型造模 按照说明书用含10%胎牛血清的DMEM培养基传代培养 HUMCE。取第3代HUMCE随机分为非造模组(N)和造模组：对照组(H/R)、卡托普利组(高(CAP1)、中(CAP2)、低(CAP3))、扶芳藤益心方组(FY)、益心方组(Y))。造模组细胞，预先用纯氮气饱和DMEM培养基10min，并充入纯氮气排净培养瓶中氧气后，密封置于37℃、5%CO2培养箱中2h后，换未经处理的DMEM培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养2h。N组在37℃、5%CO2培养箱中培养同等时间。

1.5 MTT法 调整非造模组与造模组HUMCE密度至每孔3×104/mL，按实验分组接种到96孔培养板中，且每组3个复孔。待细胞贴壁后弃各组细胞上液，FY、Y、CAP1、CAP2、CAP3各组均加入100μL相应的含药血清，N、H/R组另加入100μL空白大鼠血清，将各组均放置在37℃、5%CO2培养箱中培养，培养12h后，向每孔中加入10μLMTT溶液，将培养板在培养箱中孵育4h，弃上液，每孔加入150μLDMSO，在摇床上低速振荡10min。用酶标仪测定在490nm处吸光值OD。

1.6 流式细胞仪检测 检测细胞Caspase-3阳性细胞数及平均荧光强度 收集各组实验干预后细胞并进行细胞计数，制备1×105/100μL细胞悬液，加入100μL 4%多聚甲醛4℃放置15mins,PBS洗细胞4次，每次400g,5min,100μL 0.1%Triton 4℃放置5min，PBS洗细胞4次，每次400g,5min,100μL Anti-Caspase-3 antibody(1∶100比例稀释)或兔IgG(1∶100比例稀释)，4℃放置30min，PBS洗细胞4次，每次400g,5min,100μFITC标记的山羊抗兔二抗(1∶100比例稀释)，4℃放置30min，PBS洗细胞4次，每次400g,5min，加入200μ的PBS，上机进行检测。

1.7 ELISA法检测 检测VEGFR-2、VEGF浓度:取试验处理后各组细胞上液，按ELISA试剂盒说明操作。

2 统计学方法 本实验所测得结果为计量资料表示，采用SPSS19.0统计软件处理，两组均数比较采用t检验，组间单因素比较采用方差分析，P<0.05为差异具有显著统计学意义。

3 结 果 3.1 对H/R后HUMCE增殖和凋亡的的影响

表2 MTT法检测各组细胞在490nm波长吸光值(OD值)统计结果(±s)

注：与非造模组比较，▲(P<0.05)；与扶芳藤益心方组比较，△(P<0.05)；与益心方组比较，□(P<0.05)

如表2所示，缺氧/复氧降低HUMCE的增殖活性且显著降低,扶芳藤益心方对H/R后HUMCE具有明显增殖作用和抑制凋亡的作用。

3.2 扶芳藤益心方对Caspase-3阳性细胞数及平均荧光强度影响 图1所示，扶芳藤益心方可提高H/R后HUMCE的增殖活性，且优于益心方组，卡托普利中、低剂量组(P<0.05)。 与扶芳藤益心方组比较，益心方组，卡托普利中、低剂量组Caspase-3阳性细胞数分别较扶芳藤益心方组降低6.77%、2.49%、5.7%，卡托普利高剂量组升高4.39%(P<0.05)。

3.3 扶芳藤益心方对VEGFR-2、VEGF浓度的影响

表3 ELISA试剂盒检测各组细胞VEGFR-2、VEGF浓度统计结果(±s)

注：与非造模比较，▲P<0.05；与FY比较，△P<0.05；与Y组比较，对照组P<0.05

表3所示，扶芳藤益心方可以提高H/R损伤后HUMCE的VEGFR-2、VEGF浓度，且优于益心方组、卡托普利低剂量组(P<0.05)，但低于卡托普利高、中剂量组(P<0.05)。

图1 流式细胞仪检测各组Caspase-3阳性细胞数用散点图表示，右上角表示阳性细胞的百分 IgG

4 讨 论 《素问》:“血气不和,百病乃变化而生”，“血能载气，气能行血”。壮医认为：“疾患并非无中生，乃系气血不均衡”。心内膜微血管内皮细胞缺血损伤大多由高血压病、冠心病等疾病所致，中医可以归纳为“胸痹”、“心悸”、“怔忡”等范畴，壮医可以归纳为“龙路病”，中医和壮医均认为由气血不调所致，以益气活血通络为治疗原则。扶芳藤益心方中，扶芳藤、人参、三七、石菖蒲均为公药，其中扶芳藤是特色壮药，《中国壮医学》载：“扶芳藤，辛、平，能通火路、龙路，舒筋脉，止出血，散瘀血，补虚”，具有补虚、活血止血、通脉络的扶芳藤在方中为主药;人参擅长补气、三七擅长祛瘀，二药共为帮药，协助主药，增强主药的作用。《中国壮医学》载：“三七，甘、微苦、温，具有止血，除瘀血，通龙路，消肿，止疼痛”。《广西本草选编》载：“石菖蒲，化痰开窍，化湿和胃，醒神益智，可温通龙路。”纵观全方，公药、主药、帮药、带药合用，符合壮医理论的组方原则。根据中医理论及理法方药原则，要遵循君臣佐使进行组方，该扶芳藤益心方中，以扶芳藤为君，人参、三七为臣，石菖蒲为佐使药。故本方既符合中医组方原则，又符合壮医理论的组方原则，四药合用，更大地发挥益气活血通络之功。

本实验研究发现，表2、图1结果显示，扶芳藤益心方可以显著改善H/R后内皮细胞的增殖活性，且较益心方，卡托普利低剂量组效果明显；扶芳藤益心方还能提高内皮细胞Caspase-3阳性细胞数，分别较益心方、卡托普利中、低剂量提高6.77%、2.49%、5.7%。表3结果显示，扶芳藤益心方通过提高H/R后内皮细胞VEGFR-2、VEGF浓度，促使内皮细胞增殖及血管重建，从而维持微血管内皮的完整性及功能，且优于益心方与卡托普利低剂量组。综上所述具有益气活血通络功效的扶芳藤益心方能够改善心内膜微血管内皮细胞增殖活性及内皮功能，而且效果均优于益心方和卡托普利中、低剂量组，为将扶芳藤益心方开发为改善缺氧/复氧损伤后心内膜微血管内皮细胞增殖药物提供了理论依据。

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(收稿2014-12-19；修回2015-01-18)

微血管 内皮细胞 动物实验 大鼠 @扶芳藤益心方

R29

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.05.047

△广西中医药大学 (南宁 530001)

▲广西中医药大学第一附属医院 ( 南宁 530023)