西安市中心医院(西安 710003) 杜旭升 黄妙毅 刘志燕 李建英

蒺藜总皂苷对大鼠肺缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

西安市中心医院(西安 710003) 杜旭升 黄妙毅 刘志燕 李建英

目的：探讨蒺藜总皂苷(GSTT)对大鼠肺缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。方法：建立在体肺缺血再灌注模型。将30只大鼠随机分为正常对照组(C组),缺血再灌注组(IR组),蒺藜总皂苷组(G组)。每组分别在再灌120min时处死10只大鼠,留取右肺组织,原位细胞凋亡检测(TUNEL)法检测肺组织中细胞凋亡指数(AI)及免疫组化法检测肺组织Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果：IR组肺组织AI、Bax/Bcl-2的表达均明显升高,而预先给予GSTT干预后，G组均可以减弱缺血再灌注诱导上述指标的变化。结论：GSTT可通过下调Bax/Bcl-2蛋白表达,从而抑制细胞凋亡，对肺缺血再灌注损伤起到保护作用。

现已证实,细胞凋亡在肺缺血再灌注损伤(LIRI)中起着重要作用,过度凋亡可引起肺组织损伤,蒺藜总皂苷(GSTT)可通过抑制细胞凋亡而对心肌及缺血再灌注后脑组织起到保护作用[1]。本研究拟通过观察GSTT对LIRI时细胞凋亡及其相关蛋白Bax/Bcl-2的影响,并探讨其可能机制。

材料与方法

1 材 料 心脑舒通胶囊(蒺藜总皂苷粉,吉林敖东洮南药业公司),凋亡检测试剂(POD,北京中山生物技术有限公司),Bcl-2、Bax 抗体(美国Santa cruz 公司),SABC过氧化物酶试剂盒购自武汉博士德公司,PBS 缓冲液：自行配制,每升中含8g NaCl,0.2gKCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4，pH调至7.4,余为市售纯试剂, 30只雄性Wistar大鼠,体重220～240g(山西医科大学动物中心提供)。

2 方 法 ①动物分组：实验大鼠随机分为3组,每组10只。正常对照组(C组)：开胸游离右肺门后,不行夹闭阻断。缺血再灌注组(IR组)：开胸游离右肺门后,夹闭阻断45min,继行再灌注120min。蒺藜总皂苷组(G组)：GSTT 以67.5 mg/kg灌胃，1次/d,连续10d,第10次灌胃后1h 行手术, 其余操作同IR 组。C 组和IR 组采用与G组相同时点与方法灌入等量生理盐水。②模型的建立：采取既往研究的建模方法[2],制成在体肺缺血再灌注模型,各组分别于再灌120min后处死大鼠,留取右肺中叶作为标本。③肺组织细胞凋亡指数(AI)检测：采用原位缺口末端标记法(TUNEL),按照试剂盒说明书对右肺中叶凋亡细胞进行定量检测，细胞核呈棕黄色为阳性细胞，高倍镜下(×400)随机选择10个视野观察阳性细胞,AI即为阳性细胞所占百分数。④免疫组化SABC法检测肺组织Bcl-2、Bax蛋白：肺组织切片常规脱蜡，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶,复合消化液暴露抗原,封闭非特异性抗原后滴加1∶100稀释的1抗，37℃1h,阴性对照为PBS替代1抗；滴加山羊抗兔II抗IgG,37℃20min；滴加SABC,37℃ 20min；DAB显色3min，然后苏木素复染、脱水、透明、封片。镜检：显色呈棕黄色为阳性表达。使用彩色图像分析系统测定吸光度值。

结 果

1 肺AI的变化 见附表。在再灌120min时，IR组AI明显升高，给予GSTT干预后G组AI均较IR明显降低(P<0.05)。

2 肺组织Bcl-2、Bax蛋白表达 见附表。在再灌120min时，C组Bax蛋白表达多于Bcl-2蛋白,其比值Bax/Bcl-2小于1，IR组Bax、Bcl-2均较C组升高(P<0.05),且以Bax升高显著。G组Bax较IR组显著降低,而Bcl-2较IR组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

附表 各组再灌120min时AI、Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2比较

注： 与C组比较，△P<0.05；与IR组比较,▲P<0.05

讨 论

LIRI是个复杂的病理生理过程，氧自由基的释放、中性粒细胞浸润、细胞凋亡等参与其发病过程[3]。我们既往研究曾报道过蒺藜总皂苷可通过抗氧化及抗中性粒细胞聚集对LIRI起到保护作用[2]，现在通过对肺组织AI、Bax、Bcl-2的检测，来研究GSTT的抗凋亡作用。Fischer 等[4]报道在肺缺血期仅少数细胞发生凋亡，但随着再灌注的开始，凋亡细胞逐渐增多，约在再灌注2h凋亡细胞数目达到峰值。基于此本实验于再灌注120min时采取标本检测凋亡相关指标。本实验显示，IR组TUNEL检测到的大量黄染的凋亡细胞，给予GSTT干预后，G组的AI较IR明显减小，提示GSTT可减轻LIRI时细胞凋亡。

细胞凋亡受多基因严格掌控，其中Bcl-2基因家族在其中发挥着重要的作用,其成员包括以Bcl-2为代表的抗凋亡基因及以Bax为代表的促凋亡基因，两者通过二聚体化过程调节细胞凋亡[5]。当肺缺血再灌注时Bax等促凋亡蛋白明显增加，而Bcl-2等抑制凋亡蛋白增加不明显，进而形成Bax/Bax同源二聚体,诱导细胞凋亡。当氧化应激减轻后，Bcl-2等抑制凋亡蛋白逐渐增多，Bax等促凋亡蛋白相应减少，Bax/Bax同源二聚体逐渐解离，与Bcl-2形成Bax/Bcl-2异源二聚体，从而抑制细胞凋亡[6-7]。本实验可见，IR组Bax升高同时，Bcl-2也较C组有所升高，可能与肺细胞受到刺激后，代偿性反应所致，是一种机体自我保护的形式，但其作用有限，仍以Bax升高占优势，Bax/Bcl-2比值增大；给予GSTT干预后，虽然G组的Bax下降明显，而Bcl-2则升高显著，Bax/Bcl-2比值明显减小，提示GSTT可通过上调Bcl-2蛋白及下调Bax蛋白，从而减轻细胞凋亡。

氧化应激可促进凋亡的发生和发展[5]，我们既往研究显示GSTT可通过抗氧自由基的释放对LIRI起到保护作用，结合本研究结果，可见GSTT可通过直接调控凋亡基因的表达及间接抗氧化，从而减少细胞凋亡，对LIRI起到保护作用。

[1] 郭 艳,殷惠军,史大卓,等.心脑舒通胶囊对高脂血症大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响[J].中国中西医结合杂志,2006,26(6)：541-544.

[2] 杜旭升,赵 卉,李建强.蒺藜总皂苷对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].临床医药实践杂志,2008,17(2)：94-96.

[3] Gennai S, Pison C, Briot R.Ischemia-reperfusion injury after lung transplantation[J]. Presse Med, 2014，43(9)：921-30.

[4] Fisher S,Cassivi SD,etal.Cell death in human lung transplantation：Apoptosis induction in human lung during ischemia and after transplantation[J].Ann Thorac Surg，2011,231：424-431.

[5] 冯冬杰,许 林.凋亡在肺缺血再灌注损伤中作用机制的研究进展[J].医学研究生学报，2010，23(2)：214-217.

[6] Chen HE，Ma YC，He JB.Ischemic postconditioning attenuates pneumocyte apoptosis after lung ischemia/reperfusion injury via inactivation of p38 MAPK[J]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi, 2014,30(3)：251-256.

[7] Rivo J，Zeira E,Galun E.Attenuation of reperfusion lung injury and apoptosis by A2A adenosine receptor activation is associated with modulation of Bcl-2 and Bax expression and activation of extracellular signal-regulated kinases[J].Shock,2007,27(3)：266-273.

(收稿：2014-11-16)

The effects of gross saponin from tribulus terrestris on apoptosis in

lung ischemia-reperfusion injury

Xi’an Central Hospital(Xi’an 710003) Du Xusheng Huang Miaoyi Liu Zhiyan et al

Objective：To investigate the effects of gross saponin from tribulus terrestris(GSTT) on pneumocyte apoptosis in lung ischemia-reperfusion injury.Methods：Thirty healthy rats were randomly divided into three groups：C group,IR group,G group. After 120 min reperfusion,TUNEL assay was applied to detect lung apoptotic index(AI) and immunohi stochemical SP technique was used to detect the expressions of Bcl-2 and Bax protein. Results:GSTT could decrease AI(P<0.05),and lower Bax protein expression(P<0.05)．Conclusion：GSTT can reduce lung apoptosis through regulating protein expressions of Bcl-2 and Bax,so that it provides significant protective effects on lung ischemia-repe rfusion injury.

Lung Reperfusion injury Apoptosis Genes,bcl-2 @Tribulus terrestris

肺 再灌注损伤 细胞凋亡 基因,bcl-2 @蒺藜总皂苷

R563.9

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.007