方卫东 唐 旭 刘源森 林 凌 黄仕新 高培丽 徐长安①

(1. 集美大学水产学院 厦门 361021; 2. 福建省海新集团有限公司 漳州 363102; 3. 国家海洋局第三海洋研究所 厦门 361005)

随着健康养殖业的发展, 有益微生物的应用越来越广泛, 如在水产养殖过程中, 使用光合细菌、枯草芽孢杆菌等微生物制剂改善养殖环境, 降低疾病的发生, 取得了较好的效果(Vanittanakomet al, 1986;Burgesset al, 1993; Barsbyet al, 2001; Vaseeharanet al, 2003; 顾继锐等, 2011; 张庆华等, 2011; 高存川等,2012; 潘娟等, 2012; 张峰峰等, 2012); 通过筛选生防细菌, 利用生防细菌对水产病原菌的抑制作用, 寻找替代抗生素的新途径, 如从高度污染的海滩污泥中, 分离得到一株枯草芽孢杆菌 LHB02对三种弧菌包括哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)都有很强的抑制作用(徐长安等, 2011); 从不同生长阶段的对虾肠道中分离对病原菌(鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌)有拮抗作用的细菌(李海兵等, 2008)。另外专家学者也开展了利用益生菌、酶制剂促进水产养殖动物的健康和提高饲料利用率方面的研究(Tamehiroet al, 2002; Liuet al, 2010), 并取得了很好的试验效果,如芽孢杆菌、低聚木糖、复合酶制剂及它们的配伍物可以促进异育银鲫的生长, 提高饲料利用率, 促进肠道有益微生物的生长和抑制有害微生物, 并且能提高肝胰脏蛋白酶mRNA表达量和肠道酶活性(刘文斌等, 2007); 在饲料中添加粪肠球菌能够促进罗非鱼生长, 提高饲料利用率, 降低血清胆固醇和甘油三酯含量以及谷丙转氨酶活性, 同时增加肠道乳酸菌数量,改善肠道微环境(周晓波等, 2014); 纤维素酶可降低动物胃肠内容物的粘稠度, 促进内源酶的扩散, 提高养分的消化吸收(胡喜峰等, 2004); 饲料中添加纤维素酶, 草鱼增重率提高, 饵料系数降低, 干物质、粗蛋白、粗脂肪和粗纤维消化率都提高, 体成分没有显著变化(高春生等, 2006)。

目前, 同时具有产酶和抗菌性能的功能菌株筛选报道较少, 本实验室在前期的功能菌筛选中, 筛选到一株既产纤维素酶又具有拮抗水产病原菌的芽孢杆菌, 本研究报道了该功能菌的筛选、鉴定, 及对功能菌产生的纤维素酶进行耐温、耐酸碱和对紫外线的稳定性进行考察, 并开展功能菌对水产常见病原菌的拮抗效果分析, 初步评估该功能菌株的价值, 为以后开发该菌株提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

用于筛菌的样品采自福建省宁德市养殖池底泥。

1.2 培养基

LB培养基: 蛋白胨10g, 酵母提取物5g, 氯化钠10g, 水 1000 mL, pH 7.2—7.4。

SLB培养基: 蛋白胨10g, 酵母提取物 5g, 氯化钠 10g, 琼脂20g, 水1000 mL, pH 7.2—7.4。

产纤维素酶培养基: 蛋白胨 9.0 g、酵母膏 10.0 g,羧甲基纤维素钠 5.0 g, 水1000 mL。

CMC-Na平板: 羧甲基纤维素钠15.0 g、硫酸铵1.0 g、酵母膏1.0 g、硫酸镁1.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、琼脂20.0 g、水1000 mL, pH为自然值。

1.3 测试菌

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila), 爱德华氏菌(Edwardsiella), 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi), 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus), 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

1.4 仪器设备

常规玻璃器皿、电子天平、超净工作台、打孔器、移液枪、台式摇床、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱,PCR仪, 核酸电泳仪, 凝胶成像仪, 多功能酶标仪和手提式紫外反射仪等。

1.5 功能菌的筛选

1.5.1 目标菌的分离 取 10g污泥样品, 加入100mL 0.85% NaCl中, 搅拌后取上层浊液置于LB培养基, 37°C, 180 r/min, 富集培养 30h后, 菌液置于75°C水浴20min。水浴后的菌液进行梯度稀释及平板涂布法进行分离。

1.5.2 功能菌产纤维素酶检测 分别挑取初筛得到的目标菌, 标示为: FA01、FA02、FA03、FA04、FA05、FA06、FA07、FA08、FA09、FA10 等以此类推, 将这些目标菌置于LB培养基中, 37°C, 180 r/min,活化6 h, 活化好的菌液按10%接种至产纤维素酶培养基, 37°C, 180 r/min, 发酵 48h 后, 10000 r/min, 离心 6min, 弃去沉淀, 得上清液, 为粗酶液; 采用CMC-Na平板, 打孔后, 孔内添加 50μL所得的上清液, 之后置于 37°C过夜; 反应后的平板用刚果红染色1h, 接着用0.85% NaCl脱色, 观察是否出现水解圈,出现水解圈的即定为功能菌。每株菌做三个重复。

1.6 功能菌的鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等, 2001)进行功能菌生物学特征观察和生理生化试验, 并结合16S rDNA序列分析方法进行鉴定。

1.6.1 生物学特征观察 将功能菌接种至 SLB培养基的培养皿平板, 放入温度设置为 37°C的恒温箱中, 培养24 h, 观察菌落形态特征。

1.6.2 生理生化试验 进行功能菌部分生理生化试验, 包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇的产酸试验; 接触酶、苯丙氨酸脱氨酶试验、明胶、淀粉、酪氨酸水解试验; V-P测定、吲哚产生试验、利用柠檬酸盐试验。

1.6.3 16S rDNA序列分析 参照文献(徐长安等,2011), 采用磁珠法基因组DNA抽提试剂盒提取功能菌全基因组。以全DNA为模板, 使用细菌16S rDNA通用引物, 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。用 Taq DNA聚合酶进行PCR扩增, PCR程序为: 94°C预变性 4min; 94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 1 min, 30 个循环;72°C 10 min 修复延伸; 4°C ∞终止反应。使用 SanPreP柱式 DNA胶回收试剂盒纯化 PCR产物。纯化后的PCR产物送至上海生工测序。将测得的16S rDNA序列输入www.ncbi.nlm.nih.gov Blast进行同源性搜索,选取其中与之同源性较高的菌株, 用 MEGA软件进行系统发育树分析, 构建进化树。

1.7 酶活特性分析

接种功能菌株至LB培养基中, 37°C, 180 r/min,活化6h, 活化好的菌液按10% 接种至产纤维素酶培养基, 37°C, 180 r/min, 发酵 24h 后, 10000 r/min, 离心6min, 弃去沉淀, 得上清液, 为粗酶液。参照文献(韩铭等, 2012; 于岚等, 2013), 采用3, 5-二硝基水杨酸比色定糖法(DNS)进行酶活测定, 分别考察功能菌株所产的纤维素酶对温度、pH值和紫外线的耐受能力。

1.7.1 酶对pH值的耐受能力检测 粗酶液在不同pH缓冲液(3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0)混合均匀, 置于37°C, 处理1h, 测定残存酶活, 以最高酶活为100%。

1.7.2 酶对温度的耐受能力检测 粗酶液分别在温度为 30、40、50、60、70、80°C的水浴锅中处理1h后, 测定残存酶活, 以最高酶活为100%。1.7.3 紫外线对酶活性的影响 粗酶液分别在紫外线波长365nm, 距离10cm下照射10、20、30、40、50、60 min后, 测定残存酶活, 以最高酶活为100%。

1.8 拮抗性能检测

1.8.1 抑菌板的制作 选择嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌, 用接种环刮下菌体接种至装有5mL LB培养基的试管中, 放入温度设置为37°C, 转速为180 r/min的摇床中培养16h后, 取1 mL的培养液至100 mL的45—50°C的 SLB培养基中, 迅速摇匀倒板, 待凝固后用打孔器打孔。

1.8.2 发酵上清的制备 功能菌FA08斜面接种至装有5mL LB培养基的试管中, 放入温度设置为37°C,转速为180 r/min的摇床中活化6 h后, 按10%的接种量至装有50 mL LB培养基的三角瓶中, 放入温度设置为 37°C, 转速为 180 r/min的摇床中发酵 17 h,10000 r/min 离心6 min, 得发酵上清。

1.8.3 采用琼脂扩散法(agar diffusion method)进行测定(Tagget al, 1971)。通过测量圆形的透明带(抑菌圈)直径的大小来表示发酵上清液抑菌活性的强弱。

2 结果与分析

2.1 目标菌筛选结果

经实验发现, 标识为 FA08的菌株, 三个重复均出现水解圈, 如图1所示, 而其它菌株未出现水解圈,因此 FA08为目标功能菌。

图1 功能菌FA08水解圈Fig.1 The hydrolysis circle of strain FA08

2.2 功能菌FA08生物学特征观察

将功能菌FA08接种至SLB培养基的培养皿平板,37°C培养 24h, 发现菌落白色微黄, 中间凸起, 表面光滑, 边缘不规则, 革兰氏染色为阳性, 产芽孢。

2.3 生理生化试验

功能菌FA08的部分生理生化实验结果如表1所示。

表1 功能菌FA08的生理生化检测结果Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain FA08

2.4 16S rDNA鉴定结果

16S rDNA测序结果显示, 菌株 FA08的 16S rDNA序列全长为1407bp。全序列见图2。将测得的序列输入国际核酸数据库(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov), 用Blast进行同源序列搜索, 在搜索结果中, 选出同源性较高的菌株系列(表2), 用MEGA 软件进行系统发育分析, 并构建系统进化树, 结果如图3所示,通过比较可以明显看出, FA08在遗传位置上与Bacillus licheniformis(X68416)和Bacillus licheniformis(NR118959)两株地衣芽孢杆菌最近, 且与Bacillus licheniformis(X68416)同源性最高达99%。结合其形态学及生理、生化特征, 鉴定功能菌 FA08为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis), 登录号为KM892857。

2.5 酶学特性分析结果

2.5.1 pH值对 FA08所产生的纤维素酶稳定性的影响 如图4所示, FA08所产纤维素酶在pH 4下稳定性最好, 且pH 3和pH 5—10下保持较好的稳定性,相对酶活保持在 85%以上, 因此该酶对酸碱的耐受能力较强。

2.5.2 温度对FA08所产生的纤维素酶稳定性的影响如图5所示, FA08所产纤维素酶在30—40°C保持较好的稳定性, 50—70°C相对酶活保持在 75%以上,80°C下相对酶活仍能保持在 70%以上, 因此该酶对温度具有较好的耐受能力。

2.5.3 紫外线对FA08所产生的纤维素酶稳定性的影响 从图6可以看出在紫外线照射的条件下FA08所产生的纤维素酶保持稳定性, 酶活均接近 100%,因此该纤维素酶对紫外线具有很强的耐受性。

图2 功能菌FA08 16S rDNA 测序结果Fig.2 The 16S rDNA sequence of strain FA08

图3 基于16S rDNA序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic dendrogram based on 16S rDNA sequence

表2 选自基因库中用于构建系统发育树的菌株及其录入号Tab.2 The strains and the accession numbers in GenBank for phylogenetic dendrogram construction

图4 pH值对FA08所产生的纤维素酶稳定性的影响Fig.4 The effect of pH on the stability of cellulase produced by strain FA08

图5 温度对FA08所产生的纤维素酶稳定性的影响Fig.5 The effect of temperature on the stability of cellulase produced by strain FA08

图6 紫外线对FA08所产生的纤维素酶稳定性的影响Fig.6 The effect of UV on the stability of cellulase produced by strain FA08

2.6 功能菌FA08发酵上清对水产病原菌的拮抗性能

拮抗试验结果表明: 如表 3所示, 功能菌 FA08对水产养殖常见致病菌: 嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用, 其中对嗜水气单胞菌抑制作用最强。

表3 功能菌FA08发酵上清对病原菌的拮抗性能Tab.3 Antimicrobial activity of FA08’s supernatant on selected pathogens

3 讨论

地衣芽孢杆菌作为生防细菌广泛应用于植物病害防治、饲料加工、医药开发、环境污染治理等方面(唐娟等, 2008)。1989年, 美国FDA和美国饲料控制官员协会公布了地衣芽孢杆菌是安全的微生物物种,可以直接饲用; 我国农业部也把地衣芽孢杆菌列入饲料添加剂目录(马鑫等, 2011), 允许在饲料中直接添加。另外, 地衣芽孢杆菌在水产养殖方面也有很好的应用价值, 如地衣芽孢杆菌作为鱼饲料添加剂, 不仅可以促进鱼体生长, 而且益于养殖水体的保护(葛文霞等, 2014); 地衣芽孢杆菌和低聚木糖, 可提高鱼体中消化酶的活性, 有助于维持肠道内的微生态平衡, 促进动物生长(刘波等, 2006); 地衣芽孢杆菌增加了肠道消化酶活性, 促进了鱼体生长(刘波等,2005)。另有研究表明, 地衣芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱的特性, 并能产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶等, 有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物, 消除抗营养因子(董尚智等, 2009)。本实验所筛选的功能菌 FA08鉴定为地衣芽孢杆菌, 且可产生纤维素酶, 预示着该菌具有较好的开发与应用前景。

通过考察地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶对酸碱稳定性的影响, 发现 FA08产生的纤维素酶对酸碱均能保持较好的稳定性, pH3和pH 5—10下相对酶活保持在 85%以上, 与杨丽娜等(2012)筛选到的芽孢杆菌属(Bacillus)微生物所产的纤维素酶相比, 在酸性条件下的耐受能力强, 具有相似性, 而在中性、碱性条件下地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶更具耐受能力。水产动物大多数无胃, 消化道呈中性(鲤科鱼类)或偏碱性(王仁华等, 2011), 因此地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶不仅适合于有胃的动物, 而且也适合应用于水产动物。另外, 地衣芽孢杆菌生长条件要求低, 繁殖快, 能迅速定植在肠黏膜上, 在短时间内成为肠道的优势菌群(张菊等, 2012), 并在肠道中发挥作用, 有利于开发成为内服的微生物制剂。

实验发现, 地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶对温度有较好的耐受能力, 耐受 80°C下相对酶活仍能保持在 70%以上, 与葛春辉(2009)筛选到的蜡质芽孢杆菌所产的纤维素酶相比, 更具有耐温特性。在饲料原料中, 杂粕类的原料粗纤维含量高, 存在抗营养因子, 大大限制了其在饲料中的使用量, 目前发酵技术的应用, 可提高杂粕类原料的使用价值, 降解杂粕原料中水产动物难以消化的纤维素, 消除抗营养因子, 提高杂粕原料的利用率。一般饲料原料的发酵温度可达60—80°C, 而地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶可较好耐受发酵温度, 可应用于杂粕的发酵, 提高杂粕的营养价值。

地衣芽孢杆菌对有害微生物具有拮抗作用: 如地衣芽孢杆菌 Wl0能产生抗菌蛋白, 对多种植物病原菌有较好的抑制效果(纪兆林等, 2013); 又如地衣芽孢杆菌 c-4具有较广的抑菌范围, 对番茄枯萎病菌、玉米弯孢叶斑病菌、胶孢炭疽病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌和西瓜枯萎病菌等均有抑制作用(孙正祥等, 2009)。然而地衣芽孢杆菌对水产养殖病原菌的拮抗特性报道较少。本实验也探讨了地衣芽孢杆菌FA08发酵上清对水产常见病原菌的拮抗效果, 发现地衣芽孢杆菌FA08对水产病原菌:嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌均有较强的拮抗作用。由于地衣芽孢杆菌具有在水产动物肠道定植的特性,这意味着地衣芽孢杆菌 FA08进入水产动物肠道后,在肠道内可产生拮抗物质, 对病原菌进行抑制或杀灭作用, 促进水产动物肠道健康, 有着重要的意义,另外, 也可利用 FA08的拮抗性能, 制备微生物杀菌剂。

本研究开展了地衣芽孢杆菌FA08的筛选与鉴定,考察了该菌的酶学性质和抗菌特性, 初步评估该菌的开发与应用价值, 下一步将进行其作为养殖动物肠道定植菌、杂粕饲料发酵菌及制备微生物杀菌剂的研究与开发, 实现FA08在水产养殖中的应用价值。

于 岚, 程 芳, 邵文琦等, 2013. 一株嗜热纤维素酶生产菌的分离、鉴定及酶学研究. 安徽农业科学, 41(17):7413—7417

马 鑫, 郭 宏, 张宝国等, 2011. 地衣芽孢杆菌作为饲料添加剂的研究进展. 中国饲料添加剂, (2): 10—13

王仁华, 刘晓兰, 王琤琤, 2011. 水产动物纤维素酶的应用研究. 饲料研究, (12): 62—64

东秀珠, 蔡妙英, 2001. 常见细菌系统鉴定手册. 北京: 科学出版社, 43—65

刘 波, 刘文斌, 王 恬, 2005. 地衣芽孢杆菌对异育银鲫消化机能和生长的影响. 南京农业大学学报, 28(4): 80—84

刘 波, 谢 骏, 刘文斌等, 2006. 地衣芽孢杆菌与低聚木糖对异育银鲫消化酶活性、肠道菌群及生长的影响. 大连水产学院学报, 21(4): 336—340

刘文斌, 尹 君, 方星星等, 2007. 3种益生素配伍对异育银鲫(Carassius auratus gibelio)生长、消化及肠道菌群组成的影响. 海洋与湖沼, 38(1): 29—35

孙正祥, 王振中, 2009. 生防细菌 C-4的特性鉴定及其对香蕉枯萎病的防治效果. 植物保护学报, 36(5): 392—396

纪兆林, 宋 浩, 徐敬友等, 2013. 地衣芽孢杆菌Wl0发酵产生抗茵蛋白的研究. 中国生物防治学报, 29(4): 579—585

李海兵, 宋晓玲, 韦 嵩等, 2008. 4株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定. 海洋与湖沼, 39(4): 374—380

杨丽娜, 杨明明, 龚月生, 2012. 产耐热性纤维素酶菌株的分离·鉴定及其酶学性质研究. 安徽农业科学, 40(14):8103—8105

张 菊, 李金敏, 张志焱等, 2012. 地衣芽孢杆菌的研究进展.中国饲料, (17): 9—11

张庆华, 封永辉, 王 娟等, 2011. 地衣芽孢杆菌对养殖水体氨氮、残饵降解特性研究. 水生生物学报, 35(3): 498—503

张峰峰, 谢凤行, 周 可等, 2012. 利用复合微生物降解养殖水体中亚硝酸盐的初步研究. 水产科学, 31(10): 593—596

周晓波, 黄燕华, 曹俊明等, 2014. 5种乳酸菌对罗非鱼生长性能、体成分、血清生化指标及肠道茵群的影响. 动物营养学报, 26(7): 2009—2017

胡喜峰, 王成章, 张春梅等, 2004. 纤维素酶在水产中的应用及展望. 中国水产, (4): 73—74

顾继锐, 苏艳秋, 伍翠芳等, 2011. 一株嗜盐光合菌的分离及对养殖污水的处理效果. 淡水渔业, 41(5): 45—51

徐长安, 罗秀针, 俞超超, 2011. 海洋源生防细菌LHB02的筛选、鉴定及其抑菌谱检测. 海洋与湖沼, 42(2): 284—288

高存川, 徐春厚, 2012. 微生态制剂在水产养殖水质改良中的应用. 湖北农业科学, 51(7): 1419—1422

高春生, 范光丽, 李建华等, 2006. 纤维素酶对草鱼生长性能和饲料消化率及体成分的影响. 中国农学通报, 22(10):473—475

唐 娟, 张 毅, 李雷雷等, 2008. 地衣芽孢杆菌应用研究进展. 湖北农业科学, 47(3): 351—354

葛文霞, 柳旭伟, 2014. 地衣芽孢杆菌在养殖业中的应用研究进展. 上海畜牧兽医通讯, (1): 17—19

葛春辉, 徐万里, 邵华伟等, 2009. 一株产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及其纤维素酶的部分特性. 生物技术, 19(1): 36—40

董尚智, 王国霞, 陈远凤等, 2009. 饲用地衣芽孢杆菌的生物学特性研究. 饲料研究, (7) 14—18

韩 铭, 袁月祥, 闫志英等, 2012. 一株产耐热纤维素酶菌株的筛选及酶学性质. 应用与环境生物学报, 18(1): 75—79

潘 娟, 李 利, 刘丽媛, 2012. 益生菌在水产养殖生产中的应用. 畜牧与饲料科学, 33(4): 90—92

Barsby T, Kelly M T, Gagne S Met al, 2001. Bogorol a produced in culture by a marineBacillussp. reveals a novel template for cationic peptide antibiotics. Org Lett, 3(3): 437—440

Burgess J G, Miyashita H, Sudo Het al, 1993. Gene transfer inChromatium purpuratum, a marine photosynthetic bacterium producing antibiotics. J Mar Biotechnol, 1(2): 101

Liu K-F, Chiu C-H, Shiu Y-Let al, 2010. Effects of the probiotic,Bacillus subtilisE20, on the survival, development, stress tolerance, and immune status of white shrimp,Litopenaeus vannameilarvae. Fish Shellfish Immunol, 28(5—6):837—844

Tagg J R, McGiven A R, 1971. Assay system for bacteriocins.Appl Microbiol, 21(5): 943

Tamehiro N, Okamoto-Hosoya Y, Okamoto Set al, 2002.Bacilysocin, a novel phospholipid antibiotic produced byBacillus subtilis168. Antimicrob Agents Chemother, 46(2):315—320

Vanittanakom N, Loeffler W, Koch Uet al, 1986. Fengycin-A novel antifungal lipopeptide antibiotic produced byBacillus subtilisF-29-3. J Antibiotics, 39(7): 888— 901

Vaseeharan B, Ramasamy P, 2003. Control of pathogenicVibriospp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimpPenaeus monodon. Lett App Microbiol, 36(2): 83—87