韩莹倩，孔江南，王 江，张 超，杨国宇

(河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室，郑州 450002)

霍乱弧菌DncV蛋白的原核表达及活性分析

韩莹倩，孔江南，王 江，张 超，杨国宇*

(河南农业大学农业部动物生化与营养重点开放实验室，郑州 450002)

DncV(VC0179)是在霍乱弧菌中发现的一种双核苷酸环化酶，其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和c-GAMP。研究发现c-di-GMP作为胞内的第二信使，通过STING信号通路激活先天性免疫应答。为了体外制备c-di-GMP用于深入研究其功能，构建了VC0179融合cherry标签的丙酸诱导型表达载体，并将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。利用丙酸钠诱导表达后，观察菌体颜色是否为红色判断融合蛋白质的表达。超声破碎细菌后经SDS-PAGE电泳检测融合蛋白质的可溶性表达。最后通过Ni-NTA Agarose亲和纯化重组蛋白质，获得的重组蛋白质进行体外酶促反应，高效液相色谱检测合成产物c-di-GMP。结果表明：成功构建VC0179丙酸诱导型原核表达载体并获得了高纯度的VC0179重组蛋白质。该重组蛋白质通过体外酶促反应可一步生成c-di-GMP。本试验建立了稳定获得具有酶活性的VC0179重组蛋白质的方法；c-di-GMP的体外合成为其后续功能研究及大量制备奠定基础。

VC0179；c-di-GMP；原核表达；酶促合成法；高效液相色谱

DncV(VC0179)是在霍乱弧菌中发现的一种催化合成c-di-AMP、c-di-GMP、c-GAMP双核苷酸环化酶[1]。其合成产物c-di-AMP与c-di-GMP作为胞内的第二信使可调节细菌体内的多种应答[2]。19世纪90年代，人们首次发现c-di-GMP对醋酸纤维杆菌的生物膜形成具有重要的调节作用，是一种新型纤维素合成酶变构调节因子[3-4]。……