李景龙， 袁永泽， 李丹丹， 杨雪婷， 耿 辉， 熊 丽， 刘德立

(华中师范大学 生命科学学院， 武汉 430079)



假单胞菌HS-D36偏苯三酚1， 2-双加氧酶克隆表达与催化特性研究

李景龙， 袁永泽， 李丹丹， 杨雪婷， 耿 辉， 熊 丽， 刘德立*

(华中师范大学 生命科学学院， 武汉 430079)

由pnpC编码的偏苯三酚1，2-双加氧酶(Hydroxyquinol 1，2-dioxygenase，PnpC)是微生物分解硝基芳香族类环境污染物的关键酶.本研究从对硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP)降解菌HS-D38(Pseudomonassp.)中克隆pnpC基因，利用E.coliBL21(DE3)高效表达重组PnpC，通过亲和色谱纯化并分析其催化特性.实验结果表明：HS-D36的pnpC开放阅读框长度为873 bp，编码290个氨基酸，酶蛋白相对分子量33 KD；20℃、异丙基硫代-β-半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导可高效表达重组PnpC；重组酶经Ni-NTA亲和色谱一步分离可达到电泳纯；纯酶比活力9.3 U/mg，纯化倍数37.2，活力收率23.8%；重组PnpC催化邻苯二酚开环反应的最适温度45℃、最适pH 5.0；Lineweaver-Burk双倒数作图表明PnpC对邻苯二酚降解的米氏常数(Km)为21.95 mol/L、最大反应速度(Vmax)为2.68 mol/(min·mg)；Fe3+、Cu2+、Fe2+和Zn2+对该酶具激活作用，Ni2+则显示抑制效应.

对硝基苯酚； 偏苯三酚1， 2-双加氧酶； 表达纯化； 催化特性

对硝基苯酚(p-nitrophenol；PNP)广泛用于化学合成农药、医药和染料.化工生产释放以及有机磷农药(如甲基对硫磷)降解产生的PNP是环境污染的重要来源，严重危害公共健康[1].PNP是国际环保组织规定的优先监测的污染物之一，水体残留上限为10 ng/L[2].PNP水溶性较强，易扩散且残留期长，是环境修复的重要对象，在水环境修复领域尤为受关注[3].与传统的化学降解比较，利用微生物代谢或关键酶降解PNP具有高效绿色、无二次污染等优点，是目前PNP环境修复研究中的热点[4-5].

自……