易杰群，邹志文*，张古忍

(1.南昌大学生命科学学院，南昌 330031;2.中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室/昆虫研究所，广州 510275)

昆虫耐寒性已被广泛研究，大量的报道围绕抗冻保护剂、抗冻蛋白和热激蛋白等几类物质来解释其机理(Graether et al.，2000;Yocum，2001;Fuller，2004)，但Miyazaki 等人(2006)却证实葱蝇Delia antique(Meigen)的耐寒性与抗冻保护剂无关，显然，昆虫耐寒性体系是一个多抗寒物质系统(Clark and Worland，2008)，有必要更全面地进行研究和探讨。

脂肪作为构成生物的三大基础物质之一，对生物体有极重要的作用。它不仅是机体重要的组成成分，广泛分布于各个组织中，也是重要的贮能、供能物质，还具有一些其它功能，如保温、保水等。在昆虫中，它不仅可以作为供能物质，还可以保护其它组织，同时在耐寒性上也起到了非常重要的作用，如供能(Canavoso et al.，2001)、影响过冷却点和冰点(张瑞和马纪，2013)以及结合自由水(常志光等，2007)等，此前已有众多文献报道了昆虫耐寒性与脂肪含量之间的关系(Steinbauer，1998;陈永杰等，2005;Bemani et al.，2012;Behroozi et al.，2012;Lehmann et al.，2012;Rousseau et al.，2012)。而作为脂肪合成的底物，脂肪酸也影响昆虫耐寒性，生物一般通过提高不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例，以此增加低温下细胞膜的流动性(Koštál et al.，2003;Michaud and Denlinger，2006;Khani et al.，2007)，而不饱和脂肪酸的合成是通过脂肪酸脱饱和酶催化完成的，其与昆虫耐寒性也有着紧密的联系。

1 脂肪含量变化及耐寒性的关系

昆虫耐寒性与其脂肪含量有着紧密的联系，通常通过增加脂肪含量以提高其耐寒性。如黑足黑守瓜Aulacophora nigripennis(Motschulsky)等在短光照下饲养脂肪积累要比长光照下多，在越冬初期(9月至10月初)急剧上升(Watanabe and Tanaka，1998);在桑螟 Diaphania pyloalis(Walke)越冬幼虫体内发现结合脂肪的含量越冬期高于越冬初期(陈永杰等，2005);杨大荣等(1988)指出虫草蝠蛾 Thitarodes armoricanus(Oberthür)幼虫越冬初期体内脂肪增加;笔者研究团队也发现西藏野外生长的蒲氏钩蝠蛾Thitarodes pui(Zhang et al.)幼虫脂肪总量随着土壤温度的升高而降低(邹志文，2009)，在低温培养下的剑川无钩蝠蛾Ahamus jianchuanensis(Yang)幼虫体内脂肪含量显著高于较高温度培养的个体(Zou et al.，2010)。这些报道均证实了昆虫通过增加脂肪含量抵抗寒冷。有趣的是，越冬昆虫体内的脂肪也存在不同的响应，如Arimania comaroffi(Ragonot)与粗角螟Ocneria terebinthina Strg.越冬期间由于分解脂肪获得能量，从而导致含量显著下 降(Bemani et al.，2012;Behroozi et al.，2012)，在红翅大小蠹Dendroctonus rufipennis Kirby成虫体内也发现脂肪含量从9月份到1月份持续下降(Rousseau et al.，2012)。

昆虫通过增加体内脂肪含量抵御寒冷，这主要是由于，其一，脂肪是生物重要的贮能、供能物质，在低温条件下可以为昆虫提供能量，为昆虫合成抗寒物质及适应低温产生的一系列生理反应提供能量(Canavoso et al.，2001)，大量的冬眠动物在冬季来临之前都会在体内贮藏丰富的脂肪，昆虫也不例外，如越冬的苜蓿切叶蜂Megachile rotundata(F.)会积累大量的脂肪(Buckner et al.，2004)。其二，昆虫体液过冷却点是衡量其耐寒性的重要指标，体内自由水含量与其过冷却点成反比关系，因此过冬时昆虫会减少体内自由水的含量，增加结合水的含量(常志光等，2007)，而脂肪能通过影响昆虫体内自由水含量(Canavoso et al.，2001)，从而改变昆虫耐寒性，如低温下Gelonus tasmanicus(Le Guillou)和Amorbus obscuricornis(Westwood)体内脂肪含量增加与含水量下降的现象证实了脂肪能够降低自由水的含量(Steinbauer，1998)，这更有利于昆虫抵抗寒冷。其三，游离脂肪与过冷却点有着紧密的联系，常志光等(2007)发现越冬意蜂 Apis mellifera ligustica(Spinola)虫体游离脂肪含量从十月开始积累，二月达到最高，并且证实了其过冷能力的变化与体内游离脂肪的含量变化呈正相关。此外，作为脂肪代谢产物的甘油是一种重要的小分子抗寒物质，能降低昆虫体内液体的冰点及过冷却点(张瑞和马纪，2013)，保护昆虫组织(Izumi et al.，2006)，这一点在二化螟Chilo suppressalis Walker 以及适应低温的白蜡窄吉丁 Agrilus planipennis Fairmaire 中都得到了证实(Ishiguro et al.，2007;Crosthwaite et al.，2011)。

作为生物体内三大基础物质之一，脂肪参与生物体内各种代谢反应，直接或间接地从各个方面影响生物体生理状态。因此昆虫脂肪含量变化影响昆虫耐寒性的机制也有很多种。但目前，脂肪与昆虫耐寒性的关系尚有待进一步的研究。

2 昆虫脂肪酸与耐寒性的研究

随着温度的降低，不仅生物体脂肪总量会发生改变，脂肪酸组成也随之改变。一般情况下，当环境温度降低时，生物体内的不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)含量上升，饱和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)含量下降。细菌、藻类、原生动物、植物和鱼类都有此现象(Los and Murata，2004)，昆虫也不例外。

研究发现苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)及两种蝽Dolycoris baccarum(L.)和Piezodorus lituratus(F.)的冬季滞育个体比活跃个体UFA 更丰富(Bashan and Cakmak，2005;Khani et al.，2007);越冬期的麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana Gehin 幼虫UFA 含量显著高于越冬后的幼虫个体，而SFA含量则正好相反(Wu et al.，2001)。Eysarcoris inconspicuous(Herrich-Schaffer)成虫的甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)及磷脂(Phospholipid，PL)中均发现UFA/SFA 比值在秋季上升，随后在温度最低的1、2月份达到最大值(Çakmak，2010);不同季节的蒲氏钩蝠蛾幼虫体内PL 脂肪酸组成呈现波动性，但UFA/SFA 比值在温度最高的7月最低，而低温月份该值都高于高温月份(邹志文，2009);晚秋的颈利虱蝇Lipoptena cervi(L.)体内UFA 也显著高于8月(Nieminen et al.，2013);气温下降时二化螟末龄幼虫体内磷脂酰乙醇胺中UFA 上升到了80%，8月到10月其幼虫体内UFA 显著增加(Izumi et al.，2009)。在极少数昆虫中存在UFA 含量与上述情况相反的调节，如秋季滞育的红蝽Pyrrhocoris apterus(L.)成虫随温度的降低UFA 比例下降(Hodková et al.，1999)。

低温时UFA 的增加及SFA 的减少不仅发生在自然条件下，也存在于人工低温驯化。5℃下快速冷驯化(1 h、2 h、3 h)及长期低温(24 h、48 h、72 h)处理的白符跳 Folsomia candida Willem个体UFA/SFA 比值持续上升(Waagner et al.，2013);冷适应后的果蝇Chymomyza costata Zetterstedt 脂肪体和肌肉组织中UFA 也有不同程度的提高(Koštál et al.，2003);在快速冷驯化的黑腹果蝇Drosophila melanogaster Meigen 细胞膜上磷脂UFA 增加(Overgaard et al.，2005)。不同温度培养下的剑川无钩蝠蛾幼虫脂肪酸组成呈现明显的规律性，随着温度的降低，UFA/SFA 从1.13 升至1.40，UFA 与培养温度呈现显著地负相关关系;对跳虫Orchesella cincta(L.)进行实验发现在将15℃饲养的个体在低温下5℃下饲养4 周后UFA/SFA 比值上升，在恒温下(5℃和20℃)饲养同样发现低温下UFA 含量更高(van Dooremalen and Ellers，2010;van Dooremalen et al.，2011);类似的现象也发生在低温诱导后的北极跳虫Megaphorura arctica Tullberg 极性脂质中(Purac'et al.，2011)。

大量的研究指出，昆虫低温耐受与膜脂组成成分变化有关(Koštál et al.，2003;Tomcala et al.，2006)，这是由于细胞膜从液相变为凝胶相的转变是未结冰条件下造成冻伤的重要原因(Michaud and Denlinger，2006)。而UFA 的增加对低温下维持细胞膜液相具有重要作用。为了维持流动性，磷脂膜中的脂肪酸需要进一步不饱和，帮助维持细胞膜的动态特性(Teets and Denlinger，2013)。膜脂成分的这种改变是冷血变温动物为了适应环境温度而做出的一种适应性调节(Koštál，2010)，其细微改变足够引起膜物理特性以及相伴的机体耐寒性的极大改变(Hazel，1995)。上述昆虫中磷脂UFA 含量的增加，对于提高其低温环境下细胞膜的流动性，增强耐寒性有着极其重要的作用。

膜脂的组成对于细胞的生物功能有着至关重要的作用(Koštál，2010)，如C16∶1、C18∶1、C18∶2 等，它们在昆虫气温响应中起到非常重要的作用，在脂肪酸组成中占有非常大的比重。25℃下未滞育红尾肉蝇Sarcophaga crassipalpis Macquart的磷脂中C16∶1、C18∶1 和C18∶2 的含量甚至占脂肪酸总量的50% 以上(Michaud and Denlinger，2006)，而生活在青藏高原的蒲氏钩蝠蛾体内甘油三脂中此三者含量占脂肪酸总量的近70%，在磷脂中也占60%左右。作为不饱和脂肪酸，C16∶1酰基链的双键存在于链的中心部位，这对单个双键来说是最大限度地提高链末端横向位移的最好位置，有助于提高膜流动性(Overgaard et al.，2005)，当温度降低时，在黑腹果蝇、葱蝇等昆虫体内都会发现C16∶1 含量增加(Overgaard et al.，2006;Kayukawa et al.，2007)。与C16∶1 作用类似，C18∶1 不仅可以提高昆虫低温下细胞膜的流动性，还可以为膜关键蛋白(膜ATPases)提供适宜的环境，当C18∶1 存在于膜中时，这种酶可以达到最佳反应环境(Starling et al.，1993)。因此，许多昆虫会在低温下增加C18∶1 含量，4℃快速驯化8 h 时的红尾肉蝇中C18∶1的比例从30%上升到47%(Michaud and Denlinger，2006);在寒冷季节金针瘿蚊Eurosta solidaginis(Fitch)幼虫中也发现了C18∶1 含量显著增加(Joanisse and Storey，1996);寒冷季节二化螟末龄幼虫体内UFA 含量的提高主要是由C18∶1 增加引起的(Izumi et al.，2009)。作为细胞膜的组分之一，C18∶2 的主要功能就是降低相变温度(Overgaard et al.，2005)，维持膜的正常流动性与渗透性(Khani et al.，2007)，如越冬前的苹果蠹蛾Cydia pomonella 体内C18∶2 含量从夏季的16.1%上升到29.9%。这类报道也出现在冷适应的果蝇C.costata 幼虫及冷驯化后的黑腹果蝇中(Koštál et al.，2003)。

此外，脂肪酸链的长度对膜脂的流动性也有影响:随着脂肪酸链的增长，链尾相互作用的机会增多，易于凝集(相变温度增高)，流动性下降。脂肪酸在长期低温下的变化与短期低温适应中的变化不一样:长期低温适应会影响脂肪酸链的长度，而短期内的适应只会增加脂肪酸的不饱和程 度(Hodková et al.，1999;Ohtsu et al.，1998)。如在果蝇体内存在冷耐受性增强后就存在C18 脂肪酸减少而C16 脂肪酸增加的情况(Ohtsu et al.，1998)。

3 脂肪酸脱饱和酶与耐寒性的关系

3.1 昆虫脂肪酸脱饱和酶的种类及基本结构

脂肪酸脱饱和酶(fatty acid desaturase，FAD)是一类在脂肪酸链上将碳碳单键转化为碳碳双键的酶。FAD 分布广泛，几乎存在于所有的生物中(曾硕士等，2008)。昆虫中FAD种类非常多，除常见的FAD9(Δ9 脂肪酸脱饱和酶)外，Cripps等人(1986)还发现家蟋等14种昆虫中均存在FAD12。此外，Stanley 等(2000)年发现家蟋有能力从头合成花生四稀酸，这表明家蟋体内有Δ9、Δ12、Δ6、Δ5 等FAD 的存在。目前在大多数昆虫中发现的FAD 都属于FAD9 或FAD11，而在少数昆虫中则还存在出一些不常见的FAD，如Δ10、Δ14、Δ12、Δ15 等(Hao et al.，2002;Roelofs et al.，2002)。这些FAD 分别催化脂肪酸链在不同的位置形成双键。

现有研究表明，大部分昆虫FAD 都是膜结合蛋白，序列在两端保守性低，但中间部分存在两个相对保守的疏水区，富含3个极保守的组氨酸基序和4 次跨膜结构域，这3个极保守的组氨酸基序与酶活性中心的形成相关，主要是螯合金属离子，结合氧(Nakamura and Nara，2004)。不同种类FAD 之间结构稍有差异。除了有3个保守的组氨酸富含区外，动物中的酰基-COA 脱饱和酶、植物及真菌中的酰基-脂肪酸去饱和酶都还存在一个细胞色素b5 的区域，主要是作为电子供体，而酰基-ACP 脱饱和酶则无该结构(Pereira et al.，2003)。

3.2 昆虫脂肪酸脱饱和酶及其基因与耐寒性的关系

FAD 作为合成不饱和脂肪酸的关键酶，对动植物耐寒性有极重要的影响。在蓝藻、黄瓜、油菜和马铃薯等许多植物中都存在FAD 及其基因的研究(范妙华等，2007)。Amiri 等(2010)指出转入了FAD12 基因的马铃薯株系在-7℃实验条件下，损伤指数最高为44.22%，这个结果显著小于对照组的66.96%。动物中也存在着大量相应的报道，Zerai 等(2010)发现12℃-14℃饲养7 d 的罗非鱼Oreochromis niloticus 肌肉组织及鳃组织中的FAD9 基因表达量分别比照组高了16 倍和2 倍。此外，Tiku 等(1996)也指出在鲤鱼肝脏对于寒冷的适应中，FAD9 基因表达量上增加了10 倍。在遮目鱼及草鱼(Hsieh and Kuo，2005)等其它动物中也存在有类似的现象。而在昆虫中，这类报道同样存在，譬如，在从室温降到15℃时，家蟋Acheta domesticus(L.)体内的FAD12 活性显著提高(Batcabe et al.，2000)。

在昆虫FAD 基因研究方面，自1997年首次从果蝇中克隆得到了FAD 基因desat1 以来，FAD9 及其基因已在许多昆虫中报道出来。迄今为止，大部分的昆虫FAD9 基因都是从双翅目(Dallerac et al.，2000)和鳞翅目(Knipple et al.，1998)中克隆得到的。研究表明该类基因在昆虫中的同源性十分高(陈丽君等，2011)。尽管FAD9 基因与耐寒性的关系已在各种生物中被报道，但是此前在昆虫中却并未有此类报道。直到2007年FAD9 与耐寒性的关系才首次在葱蝇D.antique 中被证实(Kayukawa et al.，2007)。目前，这个结论也仅在白纹伊蚊Aedes albopictus 及红尾肉蝇S.crassipalpis 等几种昆虫中被证实(Rinehart et al.，2010;Reynolds et al.，2012)。在这些昆虫中，此类FAD 经鉴定均为FAD9。

Kayukawa et al.(2007)报道了在葱蝇体内FAD9 基因与耐寒性相关，这也是在昆虫中首个证实该基因与昆虫耐寒性相关的报道，他们发现，当温度降低时，在葱蝇大脑、马氏管、中肠等组织中该基因表达量上升了2-10 倍，这表明了昆虫的耐寒性与 FAD9 的正相关性关系。此后，Rinehart 等(2010)利用抑制性消减杂交技术对红尾肉蝇滞育相关基因进行分析，同样发现了FAD9基因表达量上升，这也证实了该基因与耐寒性相关。2012年Reynolds 等利用实时荧光定量PCR 技术对滞育白纹伊蚊的21个基因进行分析，发现在低温下滞育6 d 的白纹伊蚊Δ9 脱饱和酶基因表达量是未滞育的1.8 倍;Waagner 等(2013)在对弹尾目跳虫耐寒性的研究中发现，5℃下48 h 后，FAD9 基因d9des 表达量上升了5 倍，这些均表明昆虫可以通过增加FAD9 基因的表达量来提高其耐寒性。

FAD9 基因能影响昆虫耐寒性的主要原因是，FAD9 是UFA 合成通路中的首个酶，它对C18∶1及C18∶2 的合成有重要作用。这两种UFA 对生物膜流动性有重要作用(Miyazaki et al.，2006;Khani et al.，2007)。因此FAD9 在UFA/SFA 比值增加、脂肪酸代谢以及调整细胞流动性方面起到关键性作用，在生物适应低温中起到非常重要的作用。当温度降低时膜脂流动性减少，以此为信号激活FAD9 合成UFA，用以增加昆虫耐寒性。FAD9 在低温下的调节机制有两种(Tiku et al.，1996):在初步降温时，FAD 活性增加，但表达量不变，这可以说是机体内已有的FAD9 活性的激活;第二种机制就是当温度降至更低时，FAD9 基因表达量增加，酶活性的进一步增加。当温度进一步从17℃降到10℃时，酶活性不能再激活，但SFA 还在减少，可能有另一种机制参与(Hazel et al.，1987)。此外FAD9 不仅与耐寒性相关，研究发现饥饿时，在家蟋体内FAD9 活性下降(Batcabe et al.，2000);在鲤鱼体内发现两种FAD9 基因，其相似度达91%，编码两种FAD，与低温相关的只有一种(Cds2)，而另一种(Cds1)在低温下却消失不见，已证实与饥饿有关(Trueman et al.，2000);跳虫亦存在2种FAD9(z9des 和d9des)，前者在低温下表达量差异不显著，后者则上升了5 倍;在冬虫夏草寄主蒲氏钩蝠蛾体内同样存在2种FAD9 基因TpdesatA 和TpdesatB，前者随气温的降低而升高，而后者在季节变化过程中却存在一个相反的趋势(Zou et al.，2011)，出现上述情况有可能是2种基因可能催化不同的底物(Dallerac et al.，2000)。FAD9 不仅与温度、饥饿相关，还有报道指出FAD9 基因还在蛾类性信息素腺体中广泛表达(Knipple et al.，1998)，与昆虫信息素合成相关。

FAD12 是另一种重要的FAD，主要作用是将双键引入C18∶1，合成C18∶2，这种脂肪酸的主要功能是降低细胞膜相变温度(Overgaard et al.，2005)，因此FAD12 对生物耐寒性有着重要的作用。FAD12 的存在在早期家蟋等14种昆虫中就得到了证实(Batcabe et al.，2000)。Overgaard(2005)也证实C18∶2 不仅可以来自于食物中，在黑腹果蝇中C18∶2 也可以自身合成。然而，有关FAD12 基因的研究却少之又少，直到2008年，Zhou 才首次在家蟋和赤拟谷盗Tribolium castaneum Herbst 中证实FAD12 基因的存在，这也是昆虫中仅有的有关FAD12 基因的报道，但是该基因与昆虫耐寒性关系的研究尚未开展;该报道还发现家蟋的FAD12 基因AdD12Des 可能来源于原始的FAD9 基因(Zhou et al.，2008)。然而这些都是基于现象的分析，并未给出更深层次的解释，详细情况还有待更深入的工作。

4 展望

昆虫脂肪酸脱饱和酶可促进不饱和脂肪酸形成，在低温下维持细胞膜的流动性，增强昆虫适应低温环境能力。因此该类酶及基因可用于基因工程，如通过增强益虫体内的诱导及表达，提高其适应恶劣环境的能力，同时亦可用生物制剂等阻断害虫体内该类酶的催化或表达过程，降低其耐寒能力，达到调控害虫的目的。这为资源昆虫的保护和利用、害虫的防控提供新的思路，在今后应用中具有广泛的前景。

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