陈丽云，郑丽华，罗 飞，张 玉，苏素文

(1.河北医科大学基础医学院药理学教研室，河北 石家庄 050017；2.河北省正定县人民医院妇产科，河北 正定 050800；3.河北省正定县疾病控制中心计划免疫科，河北 正定 050800；4.河北省计划生育科学技术研究院生殖医学中心，河北 石家庄 050071)



·论 著·

缓激肽受体拮抗剂对卵巢癌细胞的作用

陈丽云1,2，郑丽华2，罗 飞3，张 玉4，苏素文1*

(1.河北医科大学基础医学院药理学教研室，河北 石家庄 050017；2.河北省正定县人民医院妇产科，河北 正定 050800；3.河北省正定县疾病控制中心计划免疫科，河北 正定 050800；4.河北省计划生育科学技术研究院生殖医学中心，河北 石家庄 050071)

目的探讨缓激肽B2受体特异性拮抗剂艾替班特(HOE-140)单独或联合应用阿霉素(doxorubicin,DOX)对人卵巢癌细胞株SKOV3 的影响及可能的作用机制。方法采用MTT法检测不同浓度的DOX或HOE-14与SKOV3作用24h后细胞的存活情况。在此基础上，比较二者联合用药和分别单独应用相同剂量的DOX或HOE-140 对SKOV3的细胞毒作用及对SKOV3 细胞凋亡的影响。结果不同浓度的DOX或HOE-140与SKOV3共同孵育24h后，均对SKOV3细胞的增殖有一定抑制作用。二者联合应用对SKOV3细胞的抑制作用明显强于单独应用(P<0.05)。二者联合应用诱导SKOV3细胞的凋亡作用明显强于单独应用。结论缓激肽受体拮抗剂HOE-140对SKOV3细胞的增殖有一定的抑制作用，并可促进其凋亡。

卵巢肿瘤；受体，缓激肽B2；表柔比星doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.007

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的三大恶性肿瘤之一，其中上皮性卵巢癌占卵巢恶性肿瘤的85%～90%，其常用的治疗方案为手术加化疗，但是多数患者停药一段时间后会复发，这可能与卵巢癌的发病机制尚不清楚和肿瘤的耐药有关[1]。卵巢癌的发病机制，目前普遍认可的观点是与卵巢持续排卵诱发的慢性炎症有关[2]。缓激肽(bradykinin,BK)是机体炎症时释放的一种血管活性肽[3]，通过与细胞膜上的B1受体和B2受体结合产生作用[4]。本研究观察BKB2受体特异性拮抗剂艾替班特(HOE-140)单独或联合应用阿霉素(doxorubicin,DOX)对人卵巢癌细胞株SKOV3 的影响及可能的作用机制，旨在找到更好的肿瘤靶位，从而改善卵巢癌患者的生存质量。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 实验所用的卵巢癌SKOV3细胞株由河北医科大学第四医院科研中心提供，HOE-140由BIOMOL公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1DOX和HOE-140 单独或联合应用对SKOV3 细胞增殖的影响 采用MTT法检测不同浓度DOX(3、10、30、100、300μmol/L)或HOE-140(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)对SKOV3作用24h后细胞的存活情况。在此基础上，比较二者联合用药(DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L)和分别单独应用相同剂量的DOX或HOE-140 对SKOV3的细胞毒作用。原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内MTT结晶形成的量与细胞数成正比，从而检测细胞增殖及抑制率。

1.2.2DOX和HOE-140 单独或联合应用对SKOV3 细胞凋亡的影响 采用DOX10μmol/L、HOE-140 10μmol/L、DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L联合应用作用SKOV3细胞24h，采用原位末端标记技术观察细胞凋亡情况。原理：细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA断裂时，暴露的3′-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜进行检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS10.0统计学软件进行数据分析，计量资料比较分别采用F检验和q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2种药物对SKOV3细胞增殖的影响MTT法检测结果显示，不同浓度的DOX(3、10、30、100、 300μmol/L)或HOE-140(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)作用SKOV3细胞24h后，均对SKOV3细胞增殖有一定的抑制作用，随着药物浓度的增加，抑制作用越来越强(图1，2)。HOE-140 10μmol/L和DOX10μmol/L对SKOV3细胞的抑制率分别为 12.7%和26.8%，而DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L联合应用的抑制率为37.5%，对SOV3细胞的抑制作用明显强于二者单独应用(P<0.05)(图3)。

2.2 2种药物对SKOV3细胞凋亡的影响TUNEL染色显示单独应用HOE-140 10μmol/L或DOX10μmol/L处理SKOV3细胞24h均可诱导SKOV3细胞凋亡，而DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L联合应用诱导SKOV3细胞的凋亡作用明显强于单独应用(图4)。

3 讨 论

卵巢位于盆腔深部，早期病变不易发现，晚期病例也缺乏有效的治疗手段，因此卵巢恶性肿瘤致死率居妇科恶性肿瘤首位，已成为严重威胁妇女生命和健康的主要疾病。卵巢癌的组织类型繁多，其中上皮性卵巢癌最为多见。手术加化疗是卵巢癌常用的治疗方案，化疗作为卵巢癌重要的治疗方法，其方案的选择尤其重要，同时化疗的不良反应也会凸显出来。DOX是最有效的化疗药物之一，临床广泛用于多种恶性肿瘤如乳腺癌、淋巴瘤、肺癌及卵巢癌等，然而剂量依赖性心脏毒性限制了DOX在临床的应用，如何减轻其心脏毒性症状并增强其抗肿瘤疗效，成为目前亟待解决的问题。

BK是机体一种非常重要的促炎症反应肽类物质，在组织损伤后介导众多的血管和炎症反应。BK对机体的作用通过与BK受体(B1R和B2R)结合起效。B1R和B2R均为G蛋白偶联受体。其中B2R在组织中固有表达，与BK亲和力高；B1R正常情况下几乎不表达，与BK的亲和力低，炎症及损伤等情况下表达量大大增加，故属诱导型受体。多种因素如多种促炎因子(白细胞介素1)、生长因子(上皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子以及脂多糖)及受体激动剂等均可促使B1R表达上调。BK与其受体结合后可激活多种信号通路[5-7]。其中蛋白激酶C通道可通过激活细胞内的第二信使(Ca2+)导致一氧化氮的产生增加[8-9]。

我们以前的研究发现，DOX一次大量给药(20mg/kg)所致的急性心肌损伤症状在BK受体基因敲除小鼠明显轻于野生型小鼠，且心肌组织中诱导型一氧化氮合酶的表达明显减弱，提示BK所介导的一氧化氮信号通路可参与DOX所致的心脏毒性，而阻断这一信号通路则可减轻损伤。最近的研究发现，多种肿瘤如卵巢癌、胃癌和肝癌的的腹腔渗液[10-11]中均有高水平的BK，提示BK可能参与恶性肿瘤的发生，BK受体有望成为恶性肿瘤的治疗靶位[8]。但目前对其亚型在肿瘤中的表达及各亚型所起的作用研究尚少，且结果也不一致[8,12]。因此，有必要深入研究BK各亚型及其介导的信号传导通路在肿瘤发生及增殖中的作用，这将有助于更好地了解肿瘤的发生和增殖机制，以便为临床更好的联合用药提供实验基础。

Kuhr等[13]研究认为，在内皮细胞，B2R的激活导致Gαq/11的活化，进而导致内皮型一氧化氮合酶的激活，使一氧化氮瞬时、小量的升高，而B1R被激活后则可通过G蛋白ai亚单位、βγ亚单位和恶性肿瘤基因依赖性ERK/MAP激酶的激活导致一氧化氮含酶的激活[14]。但这一信号通路在卵巢癌的发生发展中是否仍然起作用有待进一步实验证实。

目前，BK受体拮抗剂已被试用于多种肿瘤，特别是肺癌和前列腺癌的治疗[8,10]。但其试用于卵巢癌的研究尚少[12]。

本研究采用人卵巢癌SKOV3细胞株，发现B2R的特异性拮抗剂HOE-140对卵巢癌细胞的增殖有轻度的抑制作用，且可增敏DOX的作用，进一步证实B2受体可参与卵巢癌的发生和发展。对经不同处理的SKOV3细胞做TUNEL染色后发现，HOE-140和DOX均可促进卵巢癌细胞的凋亡。HOE-140作为BKB2R的特异性拮抗剂，可直接抑制BK介导的作用。因此，HOE-140有望成为一种新的、有潜力的抗卵巢癌的药物。

肿瘤的发生是多因素协同作用的结果,随着人们对BK及其受体的深入研究,BK及其受体在肿瘤发生发展中的作用和确切的作用机制，以及在肿瘤临床应用中的价值将逐渐被阐明。本研究结果显示，BK受体特别是B2R在卵巢癌的发生中有非常重要的作用，其拮抗剂对卵巢癌SKOV3细胞的生长有一定的抑制作用，同时可诱导细胞的凋亡，所以BKB2R拮抗剂有望成为卵巢癌治疗的新靶点。不过迄今为止，有关HOE-140的抗卵巢癌作用一直没有明确的报道，就目前总体而言，对HOE-140的药理作用尚了解不多。

综上所述，BK受体拮抗剂HOE-140 和DOX均对SKOV3细胞的增殖有一定的抑制作用，其作用可能与促进细胞凋亡和抑制一氧化氮产生有关。(本文图见封三)

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(本文编辑：赵丽洁)

The role of bradykinin receptor antagonists in ovarian cancer

CHENLi-yun1,2，ZHENGLi-hua2，LUOFei3，ZHANGYu4，SUSu-wen1*

(1.Department of Pharmacy,the School of Basic Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,the People's Hospital of Zhengding County,Hebei Province,Zhengding 050800,China; 3.Department of Immunology,Disease Control Center of Zhengding County,Hebei Province,Zhengding 050800,China； 4. Department of Reproductive Medicine Center，Research Institute for Family Planning of Hebei Province，Shijiazhuang 050071，China)

ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectsofB2receptorantagonistHOE-140aloneorincombinationwithdoxorubicin(DOX)onhumanovariancancercelllines(SKOV3)andpossiblemechanismsofaction.MethodsSKOV3cellswereculturedinthepresenceofdifferentconcentrationsofHOE-140orDOXfor24h.Then,thesameconcentrationsofHOE-140andDOXaloneorincombinationwereusedtoobservethesynergisticinteractionandtheinfluenceonapoptosisofSKOV3cells.ResultsBothHOE-140andDOXinhibitedtheproliferationofSKOV3cellsinaconcentration-dependentmanner.TheeffectofcombinationonSKOV3cellsshowedasynergisticeffects(P<0.05).Thecombinationeffectofthetwodrugswasstrongerthanmedicationalone.ConclusionBradykininreceptorantagonistHOE-140inhibitedtheproliferationofSKOV3cellsandcanpromoteapoptosis.

ovarianneoplasms;receptor,bradykininB2;epirubicin

2015-07-28；

2015-08-31

国家自然科学基金课题(81273600)；河北省自然科学基金课题(2011206145)

陈丽云(1976-)，女，河北正定人，河北省正定县人民医院副主任医师，医学硕士，从事妇产科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail:suswmk@163.com

R

A

1007-3205(2015)11-1264-04