徐 蕴 张肇林 窦珊珊 崔利德

(1济宁医学院基础学院， 山东 济宁 272067；2蓬莱市人民医院，山东 蓬莱 265600)

·基础医学·

乳腺癌组织CCR7的表达及其与上皮间质转化的关系*

徐 蕴1张肇林2窦珊珊1崔利德1

(1济宁医学院基础学院， 山东 济宁 272067；2蓬莱市人民医院，山东 蓬莱 265600)

目的 研究趋化因子受体-7(chemokine receptor 7,CCR7)在乳腺癌组织中的表达及临床意义，并探讨CCR7与上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)的关系。方法 采用免疫组织化学检测CCR7、EMT相关标志物转录因子Slug和N-cadherin的表达，分析CCR7与患者病理特征的关系。结果 1)CCR7在淋巴结转移组的表达明显高于无淋巴结转移组(χ2=5.061，P<0.05)；2)CCR7在人乳腺癌组织的表达随患者病理分期的增加(Ⅰ→Ⅳ)而增加；3)CCR7、Slug和N-cadherin在人乳腺癌组织中均呈高表达，阳性率分别为60.71 % (34/56)、66.07 % (37/56)、76.78 % (43/56)；4)CCR7与Slug、N-cadherin在乳腺癌组织的表达均呈正相关(P<0.05)。结论 CCR7在人乳腺癌组织中的表达与EMT的指标密切相关，可能是判断癌转移的特异性指标。

CCR7；乳腺癌；Slug；N-cadherin；淋巴转移

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，而乳腺癌细胞转移是患者死亡最主要的原因[1]。乳腺癌细胞侵袭转移等病理过程涉及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。目前，EMT发生的分子机制还不完全清楚。最近有研究报道，CC族趋化因子受体-7(chemokine receptor 7，CCR7)的配体CCL21可调节EMT细胞向淋巴内皮细胞趋化迁移[3]。然而，CCR7与某些肿瘤细胞发生EMT的关系及机制尚不清楚。本文采用免疫组织化学检测CCR7的表达，分析其表达与EMT的关系，探讨CCR7的临床意义。报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料

收集蓬莱市人民医院乳腺癌手术切除标本56例。其中>50岁者29例，≤50岁者27例；淋巴结转移者40例，非转移者16例；临床病理分期Ⅰ～Ⅱ者31例，Ⅲ～Ⅳ者25例。患者术前均未接受任何放疗及化疗，术后均经病理组织学检查确诊为乳腺癌。标本组织经4% 甲醛浸泡固定并经石蜡包埋，连续5μm 切片。

1.2 主要试剂

小鼠抗人CCR7 单抗购自美国Santa Cruz公司；小鼠抗人 Slug 单抗及N-cadherin 单抗；山羊抗小鼠二抗试剂盒、DAB 显色液均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色 组织切片常规脱蜡、水化；组织抗原采用0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲剂热修复(100 ℃、15 min)，自然冷却至室温；PBS洗涤后，用3%的过氧化氢浸泡10 min，以灭活内源性过氧化物酶。PBS冲洗5 min/次，共3次，加入山羊血清封闭20 min，然后滴加小鼠抗人CCR7(1∶300)/Slug/N-cadherin(1∶200)一抗，放入4 ℃冰箱过夜；PBS冲洗5 min/次，共3次，滴加山羊抗小鼠二抗孵育20min，PBS浸洗，DAB显色，苏木精复染，在光学显微镜下观察染色情况。以PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3.2 免疫组化阳性评价 以细胞膜或胞质出现棕黄色颗粒为阳性，以阳性细胞百分率和着色强度的评分作为标准，采用半定量积分法判断染色结果。着色强度与背景色相比记分如下：无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。阳性癌细胞百分率记分：在低倍镜下随机选取5个视野，高倍镜下计数，每个视野记录100个细胞，计算阳性细胞百分率，取平均数，其中无阳性细胞即0%为0分；0%～25 % 为1分；25%～50 % 为2分；>50 % 为3分。以着色强度与阳性细胞百分率评分的乘积作为最终分值，范围从0至9；<4分记为阴性或低表达，≥4分记为阳性或高表达。

1.4 统计学方法

应用 SPSS 17.0 软件进行数据统计分析。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中CCR7与EMT相关标志物的表达

56例人乳腺癌组织中CCR7、Slug及N-cadherin蛋白均呈高表达，表达率分别为60.71 % (34/56)、66.07 % (37/56)、76.78 % (43/56)。CCR7与N-cadherin主要表达于癌细胞质内和细胞膜，Slug蛋白主要表达于细胞核(图1)。此外，在细胞基质及癌旁组织中也检测到CCR7、Slug及N-cadherin。

2.2 CCR7表达与临床病理特征之间的关系

CCR7、Slug及N-cadherin 的表达与患者的年龄无关(P>0.05)；CCR7、Slug及N-cadherin在淋巴结转移组中的阳性表达率为70.00% (28/40)、75.00 % (30/40)、85.00 % (34/40)，而无淋巴结转移组的阳性表达率为37.50 % (6/16)、43.75 % (7/16)、56.25 % (9/16)，有淋巴结转移的患者CCR7、Slug及N-cadherin的表达明显高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P<0.05)；CCR7、Slug及N-cadherin在临床病理分期Ⅰ～Ⅱ中的阳性表达率为51.61 % (16/31)、54.84 % (17/31)、64.52 % (20/31)，而在Ⅲ～Ⅳ分期中的阳性表达率为80.00 % (20/25)、84.00 % (21/25)、92.00% (23/25)，临床病理分期Ⅲ～Ⅳ期的患者CCR7、Slug及N-cadherin的表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

A:CCR7；B:N-cadherin；C:Slug

图1 CCR7/N-cadherin/Slug在乳腺癌组织中阳性表达(免疫组化染色 ×400)

表1 CCR7、EMT相关标志物的表达与乳腺癌患者临床特征的关系

2.3 CCR7与Slug、N-cadherin表达的相关性

对56例人乳腺癌组织中CCR7、Slug及N-cadherin的表达结果分析显示： CCR7的表达与Slug(r=0.393，P=0.001)、N-cadherin(r=0.39，P=0.002) 均呈正相关，见表2。

表2 人乳腺癌组织中 CCR7与 N-Cadherin/Slug之间的表达关系

3 讨论

淋巴结转移是乳腺癌最重要的生物学特性之一，也是影响其预后的关键因素。目前肿瘤细胞向淋巴结或其他器官侵袭转移的分子机制依然未完全被阐明。

CCR7属于G蛋白偶联的跨膜蛋白，主要表达于T淋巴细胞和成熟树突细胞表面，其配体是CCL21或CCL19[4-5]。CCR7及其配体在介导机体内淋巴细胞的迁移过程中具有重要作用[6]。近来研究显示：CCR7广泛表达于多种肿瘤细胞并且与淋巴结转移密切相关，如乳腺癌、食管癌以及头颈癌[7]；CCL21/CCR7在肿瘤细胞侵袭与转移过程中发挥十分重要的作用。

EMT是指上皮细胞失去其细胞极性、细胞间黏附力下降、具有较强的运动性等间质细胞表型的生物学过程，在胚胎发育、慢性炎症、多种纤维化疾病和肿瘤转移中发挥重要作用[8]，其主要特征包括黏附分子如E-钙黏蛋白 (E-cadherin) 的表达降低同时获得转录因子Snail、Slug以及N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达[9]。EMT标记物广泛表达于多种肿瘤并且与肿瘤的侵袭扩散有关。已发现许多因子能激活肿瘤细胞相应受体信号程序发生EMT，使其获得侵袭转移能力，如胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF-β)。本文采用免疫组化检测了CCR7及EMT标记物Slug、N-cadherin在人乳腺癌组织中的表达。结果显示，癌细胞CCR7、Slug及N-cadherin的表达与淋巴结转移及临床病理分期密切相关，有淋巴结转移者及乳腺癌Ⅲ～Ⅳ期患者的CCR7、Slug及N-cadherin的表达明显升高，说明CCR7可能促进乳腺癌细胞的浸润转移过程。而后我们进一步分析了CCR7与EMT标记物(Slug、N-cadherin)之间的相关性，发现CCR7的表达与Slug、N-cadherin的表达均呈正相关，提示CCR7与乳腺癌EMT的发生关系密切，其机制有待进一步实验研究证实。信号通路研究表明，CCR7可通过激活MAPK、AKT信号途径参与基因的转录调控[10]。而在EMT的发生中，MAPK、AKT可以激活Smad、Slug及Twist[11]等转录因子，共同调节EMT标志物的表达。因此，我们认为CCR7可能通过激活MAPK或AKT途径而激活Snail、Slug及Twist等转录因子，进而诱导乳腺癌细胞表达N-cadherin等EMT标志物，发生转移；可能是判断癌转移的特异性指标。

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Expression of CCR7 and its correlation with epithelial-mesenchymal transition in breast carcinoma

XUYun,ZHANGZhaolin,DOUShanshan,CUILide

(School of Basic Sciences,Jining Medical University,Jining 272067,China)

ObjectiveTo investigate the association between the expression of CCR7 and clinical parameters in human breast carcinoma and analyze the relationship between CCR7 and the epithelial-mesenchymal transition (EMT).MethodsCCR7,Slug and N-cadherin were examined by immunohistochemistry in 56 cases of breast carcinoma tissues.The correlation between clinical parameters and CCR7 expression were retrospectively analyzed.Results1)The expressions of CCR7 in lymph node metastasis group were significantly higher than those in the group that without lymph node metastasis (χ2=5.061，P<0.05).2)The expression of CCR7 in human breast cancer increased with the increase of the pathological stage of the patients.3)High expressions of CCR7,Slug and N-cadherin were found in human breast carcinoma and the positive rate was 60.71%,66.07% and 76.78 % respectively.4)The CCR7 expression was significantly associated to Slug and N-cadherin(P<0.001).ConclusionCCR7 was closely related to EMT indicators (Slug and N-cadherin) in human breast carcinoma.CCR7 may play a role in the genesis of EMT in human breast carcinoma and be expected to become the biomarker of cancer metastasis.

CCR7;Breast carcinoma;Slug;N-cadherin;Lymph node metastasis

* [基金项目]2013年济宁医学院科研计划项目(编号：JY2013KJ014)

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.06.003

R737.9

A

1000-9760(2015)12-394-04

2015-09-08)