秦 涛(重庆市九龙坡区妇幼保健院检验科 400051)



·论 著·

不同标本及组合对荧光探针法诊断儿童手足口病的价值评估

秦 涛(重庆市九龙坡区妇幼保健院检验科 400051)

目的 评估不同临床标本及组合在实验室采用荧光探针法诊断儿童手足口病的价值。方法 收集680例临床诊断为手足口病的咽拭子和肛拭子标本，其中有溃疡表征的标本223例，有疱疹液的标本522例，有脑膜炎症状的血清和脑脊液标本76例，采用荧光探针法检测肠道病毒肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)及通用型。结果 单一标本肠道病毒通用型咽拭子阳性检出率(70.29%)最高，其余依次为肛拭子(65.15%)，疱疹拭子(63.03%)，溃疡拭子(43.95%)，脑脊液(2.63%)，血清(1.32%)；对于有全套标本的患儿咽拭子确诊率达74.15%，咽拭子与疱疹拭子组合确诊率达91.7%，咽拭子与肛拭子组合确诊断率为89.26%，全套标本组合将诊断率提升至95.61%；单独一个的疱疹拭子与溃疡拭子诊断率分别为63.03%和43.95%，当疱疹拭子与溃疡拭子为2个诊断率分别为66.67%和47.09%，当疱疹拭子与溃疡拭子为3个诊断率分别为67.24%和47.98%，大于等于4个时诊断率将不再提升。结论 对手足口病标本进行实验室检测时，首选咽拭子标本，将咽拭子与其他标本组合将明显提升诊断率；血清和脑脊液标本对临床诊断是否感染手足口病不是必须的选择；对于暴发手足口病采集全套咽拭子、肛拭子、疱疹拭子、溃疡拭子标本十分必要；采集疱疹拭子与溃疡拭子标本时同时采集2～3个拭子是较为可靠的做法。

手足口病； 标本； 荧光探针法

手足口病(HFMD)是近年一种常见的发热性疾病；多发于婴幼儿中，表现为皮肤与口腔黏膜病变、斑丘疹或疱疹，通常出现在手掌或脚掌上，也可波及臀部、肘部及膝盖。口腔溃疡是最为常见的黏膜疹，某些患者还会出现疱疹性咽峡炎。2008年5月我国卫生部将手足口病纳入法定报告的丙类传染病，而且已成为我国各类传染病中发病数最高的丙类传染病[1]。肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)均为引发HFMD的主要病原体。为了评估不同标本及组合使用荧光探针法检测HFMD的价值，本实验室对临床诊断为HFMD的患儿根据表征不同采集了咽拭子、肛拭子、溃疡面拭子、疱疹拭子及血清、脑脊液进行检测，以期发现更优化的标本组合，从而为临床HMFD的诊断及日常病原学监测提供准确有效依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月至2014年3月本院收治的HFMD患儿680例，其中男399例，女281例，年龄3～125个月，平均年龄(30±8)个月。当儿童出现以下(至少1种)发病征象时，即被临床诊断为HFMD：手掌和(或)脚掌出现斑丘疹和(或)水疱疹；口腔出现小水泡或溃疡，或疱疹性咽峡炎(又称为多发性口腔溃疡，以口腔后部为主)[2]。

1.2 标本采集 采集咽拭子时，需配合使用压舌器；取样时，用轻柔而灵敏的动作擦拭咽后部及两侧(不能触碰舌头与峡黏膜)。采集直肠拭子标本时，先将拭子插入肛门，然后旋转擦拭肛门周围及直肠壁。仔细检查患儿的皮肤上是否有水疱，口腔内是否有溃疡；若有，则用棉签擦拭至少1个(最大或最容易接触的)病变部位，以采集疱疹拭子和(或)溃疡拭子标本。在采集疱疹拭子时，需先用0.9%的无菌生理盐水轻柔地擦拭取样部位；禁止使用酒精，有可能会杀灭病毒。使用一根无菌针刺破水疱，然后再用拭子吸取水疱液；也可用拭子轻柔地在水疱上翻滚挤压，以挤出水疱液。若疑似中枢神经系统(CNS)损伤的患儿伴有发热史、发热症状(体温大于或等于38 ℃)或以下症状(至少1个)时，采集其脑脊液和血清标本。(1)外观呈现毒性或病变；(2)再发性呕吐(至少两次)；(3)心跳过速(心率大于150次/分)；(4)呼吸急促；(5)神志衰减(易怒、嗜睡、精神欠佳、昏迷)；(6)四肢无力、假性脑膜炎(颈强直或克氏征)或癫痫。采样后，立即将标本置于-70 ℃冰箱中。如在正常工作时间之外采样，无法即刻将标本置于-70 ℃的冷藏环境中时，可先将临床标本冷藏在4 ℃的环境中过夜，第2天尽快将标本置入-70 ℃冰箱中。

1.3 荧光探针法检测 EV71型、CAl6型和肠道病毒通用型核酸检测试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司产品，标本处理与一步法荧光探针法RT-PCR检测具体操作参考说明书执行。

2 结 果

2.1 不同标本的肠道病毒阳性检测出率 肠道病毒通用型荧光探针法的核酸扩增体系包含了EV71和CA16的扩增引物，因此通用型的阳性率可作为不同标本的阳性检出率指标，通用型咽拭子(70.29%)>肛拭子(65.12%)>疱疹拭子(63.03%)>溃疡拭子(43.95%)，其中咽拭子阳性检出率最高。680例患儿咽拭子标本中197例(28.97%)为EV71阳性，209例(30.74%)为CA16阳性，其中有23例EV71合并CA16阳性。本次研究根据患儿的临床表征进行了血清和脑脊液检查，受测患儿共计76例；荧光探针法血清检出病毒的仅为1例，脑脊液检出病毒仅2例。见表1。

表1 不同类型标本的肠道病毒阳性检出率

表2 疱疹拭子和溃疡拭子的采样数量与阳性

2.2 标本组合分析 680例受测患儿中，同时具备疱疹与溃疡表征的患儿为205例，这一分析的研究对象仅为具备全套标本的患儿(血清和脑脊液阳性检出率非常低，不进一步作为本分析标本)。单独使用咽拭子确诊了152例(74.15%)；单独使用疱疹拭子确诊了138例；单独使用直肠拭子确诊了134例；单独使用溃疡拭子确诊了92例，咽拭子的阳性检测率仍是最高，故将咽拭子作为第1标本。若同时加入疱疹拭子进行检测，则肠道病毒通用型阳性增至179例；若同时加入直肠拭子进行检测，肠道病毒通用型阳性为174例；若同时加入溃疡拭子进行检测，肠道病毒通用型阳性为155例。在此基础上，可将疱疹拭子作为第2标本，此时加入直肠拭子结果通用型阳性数为188例；加入溃疡拭子结果则为183例。以此类推，加入直肠拭子作为第3标本，加入溃疡拭子作为第4标本。得到通用型肠道病毒阳性数为196例，诊断率将升至95.61%(196/205)。

2.3 疱疹拭子和溃疡拭子的采样数量与阳性数量之间的关系 检测中为522例出现水疱疹的HFMD患儿采集了至少1个(平均值为2个，范围1～10个)疱疹拭子；为223例出现溃疡的HFMD患儿采集了至少1个(平均值为2个，范围1～6个)溃疡疹拭子。检测结果显示，63.03%的单次疱疹拭子检测呈阳性，43.95%的单次溃疡拭子检测呈阳性。见表2。

3 讨 论

自1997年以来，HFMD在亚太地区的多次爆发，带来了巨大的经济损失与社会负担[3-5]。部分患儿可能并发病毒性脑炎、脑脊髓炎，个别患儿病情发展迅猛，继发脑干脑炎、神经源性脑水肿、肺出血，严重者甚至发生死亡[6]。为了明确HFMD病原体感染源，临床检验需面对各种不同的标本，并从中选出最为有效的检测方案。

近年来，大部分关于HFMD感染的研究手段大多为粪便培养与咽拭子分析[5-7]。结果显示，后者的灵敏度更高，咽拭子检测结果呈阳性的比例为受测患儿的90%～95%；而粪便培养结果呈阳性的比例则仅为受测患儿的40%～65%，且少见针对HFMD大标本进行系统性研究[7-8]。2000年，新加坡爆发了大规模的HFMD；当时有人对175例HFMD患者进行了调查研究，其研究报告指出，病毒诊断率由高到低依次为：直肠拭子、粪便标本、疱疹拭子、咽拭子。但是，本研究结果却发现，对于大部分患儿而言，咽拭子是阳性诊断率最高的单一标本：在205例具备全套标本的患儿中，其阳性诊断率为152例(74.15%)；在680例受测患儿中，其阳性诊断率为478例(70.29%)。

HFDM患儿的疱疹一般出现在起病初期，通常几天后消失，应提示临床选择最佳的检测时机。有学者曾从4例患儿的疱疹拭子中分离出了病毒[8]。在本实验室检测的病例中，有近一半患儿出现了皮肤疱疹，研究结果证明，疱疹拭子检测有较高的阳性检出率。在出现疱疹表征的患儿中，疱疹拭子的诊断率列第2位，205例接受检测患儿的阳性检出率为138例(67.31%)，相对无菌的疱疹液在病原学诊断上也更有价值。

为了找出标本组合的最优数量，在采集疱疹拭子时，可试着采集多个单独的疱疹拭子并进行叠加。研究发现，当为每位受测患儿采集1个疱疹拭子时，阳性检出率为63.03%；当该数量增至2个时，阳性检出率达到66.07%；当该数量增至3个时，阳性检出率升至67.04%，当大于等于4个时阳性率不再增加。因此建议，在采集疱疹液时，1个疱疹拭子应同时擦拭吸取2～3个水疱的疱疹液。这种做法可以使病毒检出率最大化，而无需增大标本处理量。

本研究报告显示，血清和脑脊液的病毒检出率较低，76例合并无菌性脑膜炎的HFMD患儿中仅发现血清检出1例，脑脊液检出2例，这一发现与有关报道相吻合[9]。

此外，本研究还逐一对单个标本进行了检查，以期发现最有效的标本组合。具体方法为：确定一种首选标本，再根据不同临床表现组合其他类型的标本，从而提高诊断阳性率。在HFMD的大规模流行期，在为患儿诊断时最好同时采集(至少)2个标本——咽拭子与另一其他类型拭子。若患儿未出现疱疹表征，则第2标本应为直肠拭子；若患儿出现了疱疹表征，则第2标本应为疱疹拭子(采集至少2个水疱的水疱液)。为患儿采集全套标本，在检测中根据阶梯分析法，从最有效的标本着手，进行合理的组合检测，可以更加准确地为重症病例提供病原学诊断依据。

[1]朱启镕，曾玫.手足口病的流行现状及挑战[J]．微生物与感染，2012，7(2)：82-88．

[2]卫生部.手足口病预防控制指南(2009版)[J].全科医学临床与教育,2010,8(2):125-127.

[3]何颜霞,付丹,操德智,等.重症手足口病分组监护治疗80例分析[J].中华儿科杂志,2009,47(5):338-343.

[4]毛国顺，罗玲，刘晓琳，等．手足口病轻症与重症患者临床特征比较[J]．中华传染病杂志，2008，26(7)：387-390．

[5]初艳慧,刘潇潇,孙小宇，等.重症手足口病例的临床特征和流行病学分析[J].实用预防医学,2014,21(9):38-39.

[6]李丽.手足口病普通和重症病例临床特征及病原学研究[J].实用医学杂志，2011，27(14)：2660-2662.

[7]杨晓红，吴茜，温柏平,等.2010年昆明地区儿童手足口病病原分子流行病学调查研究[J].中国当代儿科杂志，2012,14(3):163-166.

[8]Chan LG,Parashar UD,Lye FG,et al.Deaths of children during an outbreak of hand,foot,and mouth disease in Sarawak,Malaysia:clinical and pathological characteristics of the disease.For the Outbreak Study Group[J].Clin Infect Dis,2000,31(3):678-683.

[9]李娟娟,苏明,王玉肖.不同标本及其组合在手足口病诊断中的意义[J].实用预防医学，2014,21(1):1006-1009.

Evaluation on value of different samples and their combination in diagnosis of hand-foot-mouth disease by fluorescence probe method

QINTao

(DepartmentofChinicalLaboratory,JiulongpoDistrictMaternalandChildHealthCareHospital,Chongqing400051,China)

Objective To evaluate the value of different clinical samples and their combination in the diagnosis of hand-foot-mouth disease(HFMD) by adopting fluorescence probe method.Methods 680 throat swabs and rectal swabs of clinically diagnosed HFMD were collected,in which 223 cases had ulcer symptom,522 cases had herpes liquid and 76 cases of serum and cerebrospinal fluid had meningitis symptoms.Then enterovirus EV71,CA16 and universal enterovirus were detected by adopting the fluorescence probe method.Results The positive rate of universal enterovirus in single throat swabs was 70.29%,showing the highest detection rate,followed by the rectal swab(65.15%),herpes swab(63.05%),ulcer swab(43.95%),cerebrospinal fluid(2.63%) and serum(1.32%);the definite diagnosis rate of throat swab with whole set of samples reached 74.15%,which of the combination of throat swab plus herpes swabs reached 91.7%,which of the combination of throat swab and rectal swab reached 89.26%,while which of whole set of samples was increased to 95.16%;the diagnosis rates of single herpes swab and ulcer swab were 63.03% and 43.95% respectively,while which of two herpes swabs and two ulcer swabs were 66.67% and 47.09%respectively,which of three herpes swabs and three ulcer swabs were 67.24% and 47.98% respectively,while which of 4 or more swabs each was not upgraded.Conclusion In conducting the laboratory detection of HFMD samples,the throat swab is the first choice,the combination of throat swab with other samples would significantly increase the diagnosis rate;serum and cerebrospinal fluid samples are not necessary choice for clinically diagnosing whether HFMD infection.It is very necessary to collect the whole set of throat swab,rectal swab,herpes swab and ulcer swab for the outbreak of HFMD,simultaneously collecting 2-3 herpes swabs and ulcer swabs is a relatively reliable way.

HFMD; samples; fluorescence probe method

秦涛，女，主管技师，本科，主要从事临床免疫检验方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.052

A

1672-9455(2015)16-2425-03

2015-02-22

2015-05-08)