马 军，马 芮，叶佳琪，李麒麟，姜芳燕，曲江勇,2

(1.琼州学院 热带生物与农学院，海南 三亚 572022；2.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264005)



红树林根际土壤中产三种酶枯草芽孢杆菌的分离鉴定

马 军1，马 芮1，叶佳琪1，李麒麟1，姜芳燕1，曲江勇1,2

(1.琼州学院 热带生物与农学院，海南 三亚 572022；2.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264005)

从红树林根际土壤中分离纯化芽孢杆菌,通过生化特征分析筛选出10株疑似枯草芽孢杆菌,产酶能力检测发现8株菌同时具备产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶能力,其中三株菌(JCHL-0209,JCHL-0207和LMJ-17)的产酶能力较高,尤其是JCHL-0207菌株的综合产酶能力最为显著,结合16s rRNA基因序列分析确定这三株菌均为枯草芽孢杆菌,这为进一步将其应用于生产实践提供了理论依据.

红树林;枯草芽孢杆菌;产酶;16s rRNA基因

0 引言

红树林是一种位于热带至亚热带的特殊生态系统,由于其经常周期性受到海水的侵淹,所以土壤兼具海洋和陆地的性质却又不同于海洋和陆地的环境特点[1-2].大量研究发现红树林具有的独特生境往往会造就一些独特的微生物种类,而这些独特的微生物往往会产生独特的代谢产物[3].

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)是芽孢杆菌属的一种,革兰氏阳性细菌,其分布广泛,并且易于分离培养.在显微镜下,可以观察到其细菌形态呈直杆状,并能在恶劣的环境条件下产生芽孢,具有较强的环境抗逆性.据资料显示,枯草芽孢杆菌一般能够产生纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等十几种酶类,同时其具有相对安全性,对机体不会产生太大的影响,因此在食品、医药、生物防治、发酵工业以及饲料养殖业等诸多领域都有着非常广泛的应用.

对于枯草芽孢杆菌的鉴定,传统的分类方法是对其形态结构进行观察与分析,然后进行相应的生化特征分析,最后参考《伯杰氏细菌鉴定手册》中对枯草芽孢杆菌的特征描述进行判断,但此方法不能确切的说明芽孢杆菌的遗传进化地位和关系.基于16s rRNA基因序列比对是目前使用较多的分子鉴定手段,利用芽孢杆菌16s rRNA基因序列的高度保守性可以比较准确的对芽孢杆菌进行分类与鉴定[4],若再结合形态结构和生理生化特征将更为准确的对枯草芽孢杆菌进行系统性的鉴定.

本研究主要是从红树林根际土壤环境中筛选出具有产淀粉酶、蛋白酶以及纤维素酶三种酶活性的特殊芽孢杆菌,并对该芽孢杆菌进行了生理生化特征分析及16s rRNA基因序列比对,最终确定其为枯草芽孢杆菌,这为进一步研究其应用于生产实践中提供了理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

红树林根际土壤样品采集于三亚市红树林生态系统保护区(白鹭公园),盐浓度为35‰.

1.1.2 培养基

促芽孢生长培养基(液体):蛋白胨 10.0 g,酵母膏 3.0 g,可溶性淀粉 3.0 g,硫酸镁 0.1 g,磷酸二氢钾 1.5 g,磷酸氢二钠 2.0 g,去离子水1000 ml,PH 7.4,121 ℃灭菌20 min.

芽孢杆菌分离培养基(固体):蛋白胨 5.0 g,葡萄糖 5.0 g,酵母膏 5.0 g,磷酸氢二钾 4.0 g,琼脂粉 18.0 g,去离子水1000 ml,PH 7.4,121 ℃灭菌20 min.

富集培养基(液体):牛肉膏 5.0 g,蛋白胨 10.0 g,氯化钠 5.0 g,去离子水1000 ml,PH 7.2-7.4,121 ℃灭菌20 min.

LB培养基:蛋白胨10.0 g,氯化钠10.0 g,酵母粉 5.0 g,去离子水1000 ml,PH 7.4,121 ℃灭菌20 min.

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离与筛选

将采集的土壤样品以1∶9的比例混合到促芽孢生长培养基中,30℃摇床培养过夜,将培养好的菌悬液置于80℃水浴锅中加热10min,吸取已经进行热处理的培养液1ml,用无菌水进行梯度稀释至10-5、10-6、10-7三个浓度梯度,每个梯度重复3次,通过平板涂布法接种于芽孢杆菌分离培养基上,30℃下培养24-48h.选取适合的平板,挑取单菌落于富集培养基中摇床培养18-24h,培养好后取少量菌液进行革兰氏染色,革兰氏染色结果为阳性的杆状菌株进行进一步的画线分离纯化,纯化后的菌株进行再次革兰氏染色鉴定,对纯的革兰氏阳性菌株进行保种.

1.2.2 形态和生理生化特征鉴定

建筑工程造价的特点就是有着非常复杂多样的多层性，所以在建筑工程造价动态管理的落实过程中，就会遇到很多的阻碍因素。调控建筑工程造价和选取管理的流程是要重点注意的两个关键的问题，在日常的管理工作当中，应该把辨别造价，拟定进度和建造的质量这三个因素结合起来去综合的考虑。选择建筑工程造价动态管理最合适的方式，有序的调节所消耗的工程的总造价，只有这样才能使建筑工程的质量达到最好，并且还可以节省成本。

上述分离纯化方法获取疑似芽孢杆菌菌株,根据革兰氏染色后菌株形态学的特性,初步选取形态学特征较为明显的菌株(革兰氏阳性、棒状或短杆状、有内生芽孢)进行生化特征分析.参考《伯杰式细菌鉴定手册》及相关文献资料,选择接触酶、糖/醇利用、V-P反应、淀粉水解、吲哚形成、明胶液化、纤维素水解、蛋白水解、硝酸盐、柠檬酸盐和硫化氢利用实验作为初步判断枯草芽孢杆菌的特征性生化指标[5-7].

1.2.3 芽孢杆菌产酶能力测定

将初步分离的疑似芽孢杆菌的单菌落分别点种到淀粉酶筛选培养基、CMC-Na纤维素酶筛选培养基和干酪素培养基上,30℃下培养48h,(1)在淀粉酶筛选培养基上滴加卢戈氏碘液,若菌落周围产生透明水解圈则表明该菌株具有产淀粉酶能力;(2)在CMC-Na纤维素酶筛选培养基上滴加刚果红水溶液,静置显色30min后用蒸馏水洗去多余染液,再加入适量NaCl溶液静置洗脱30min,最后再用蒸馏水清洗一次.若产生水解圈则表明该菌株具有产CMC纤维素酶能力;(3)在干酪素培养基上的菌落周围产生透明的水解圈则表明该菌株具有产蛋白酶能力.一般而言,测量的菌落直径大小(CD)和水解圈直径大小(HD)的比值(HD/CD)越大,表明菌株产酶能力越强.因此,每株菌株进行至少三次生物学重复,通过比较HD/CD的比值初步筛选出具有较强产酶能力的菌株[6-7].

1.2.4 细菌16s rRNA基因序列比对分析

使用Axygen细菌基因组DNA提取试剂盒(AXYGEN:AP-MN-BT-GDNA-50),参考试剂盒说明书进行细菌基因组DNA的提取.16s rRNA基因保守序列使用通用引物16s-FP: 5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和16s-RP: 5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'进行PCR扩增[8].50μl反应体系:模版DNA 2μl,上下游引物各1.5μl,10×Buffer 5μl,Taq DNA聚合酶 1μl,dNTP 2μl,加无菌水至50μl.PCR条件为94℃预变性5min,94℃变性1min,55℃退火30s,72℃延伸90s,30个循环.取PCR产物进行目的片段的分离和纯化,然后将纯化后的DNA片段和pMD 19-T Vector进行体外连接,连接产物转化到DH5α感受态细胞中,涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上,37℃培养24h.挑取单克隆进行菌落PCR检测,筛选阳性重组子,提取质粒送深圳楉柚基因科技有限公司测序.

不同菌株16s rRNA基因的测序序列在GenBank的数据库中进行BLAST分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),获取相似的同源参考序列,然后所有的序列利用Clustal W 1.6进行全序列比对,构建系统发育树采用MEGA 5.1软件的Neighbor-Joining算法[9],进化距离使用Kimura 2-parameter模型进行计算,系统发育树使用1000次重复的Bootstraps进行统计学检验.

2 结果与分析

2.1 细菌的分离与鉴定

从红树林根际土壤中分离纯化得到的菌株进行革兰氏染色,确定其为革兰氏阳性菌后,取其中形态特征较为明显的19株菌株进行一系列的生化鉴定实验分析,参照《伯杰式细菌鉴定手册》,筛选接触酶、V-P反应、明胶水解和硝酸盐利用为阳性的菌株[6-7],初步确定了10株疑似枯草芽孢杆菌,分别为JCHL-0207、JCHL-0209、CY-1、LMJ-17、YJQ-30、YJQ-69、YJQ-52、YJQ-40、YJQ-53、MR-0302和WI-252,其结果见表1.

表1 菌株的生化鉴定结果

(“+”表示该指标呈阳性；“—”表示呈阴性。)

将19株芽孢杆菌(包含10株疑似枯草芽孢杆菌的菌株)分别点种于淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶筛选培养基上,培养48h后,测量不同筛选平板上单菌落的直径(CD)和水解圈或透明圈的直径(HD),通过比较HD/CD的比值来判断不同菌株产酶能力的大小.从表2可以看出,能够同时表现出淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的菌株共有10株,即JCHL-0207、JCHL-0209、CY-1、LMJ-17、YJQ-41、YJQ-30、YJQ-69、YJQ-2、YJQ-40和WI-252,这包含8株初步判定的疑似枯草芽孢杆菌(JCHL-0207、JCHL-0209、CY-1、LMJ-17、YJQ-30、YJQ-69、YJQ-40和WI-252).菌株YJQ-45的三种酶活性均未被检测到,这明显不符合枯草芽孢杆菌具有丰富酶系的特性.此外,与其他产三种酶的菌株的产酶能力相比,JCHL-0207、JCHL-0209和LMJ-17这三株菌具有较为明显的高产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶的综合能力,尤其是JCHL-0207菌株,其综合产酶能力最为突出.

表2 芽孢杆菌产酶能力测定结果

(“∕”代表未检测到或不明显；“*”表示显著性，α=0.05)

2.3 细菌16s rRNA基因序列的系统进化分析

根据上述生化特征分析及产酶能力分析结果(见表1和表2),选取10株菌株,即JCHL-0207、JCHL-0209、CY-1、LMJ-17、YJQ-30、YJQ-69、YJQ-52、YJQ-40、YJQ-53、和WI-252,进行16s rRNA基因同源比对及系统发育分析,其Genbank分配号分别为KP834902、KP834901、KP834904、KP996671、KP834899、KP834895、KP834897、KP834898、KP834896和KP834900.以多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)为外群构建16s rRNA基因序列系统发育树(如图1所示),10个待鉴定菌株形成了2个主要大分支,其中LMJ-17、YJQ-30、JCHL0209、YJQ-53、YJQ-40和JCHL0207位于枯草芽孢杆菌大分支中,而YJQ-69、CY-1和WI-252位于腊样芽孢杆菌大分支中.

在枯草芽孢杆菌大分支中,JCHL0209与枯草芽孢杆菌KJ957013的相似性达到99.5%,YJQ-40和JCHL0207形成一个小分支,位于枯草芽孢杆菌大分支中,其相似性达到99.5%.值得一提的是,YJQ-52与特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)KC851837一起形成一个小分支,并位于枯草芽孢杆菌大分支中,其相似性达到99.7%,造成这种结果的原因是特基拉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌16s rRNA基因序列极为相似(达到99%以上),两者的生化特征也较为相似,在区分这两种菌株时如果仅仅使用16s rRNA基因序列比对,则很容易将两种菌构建到一个分支中,需要结合其他手段才能将两者进行区分[10].

在蜡样芽孢杆菌大分支中,YJQ-69与蜡样芽孢杆菌(B.cereus)KF853117的相似性为99.9%,WI-252与蜡样芽孢杆菌FJ210679的相似性为99.5%,CY-1与菌株KJ722447的相似性达到99.7%,而与WI-252的相似性为99.0%.

图1 芽孢杆菌的16s rRNA基因系统发育树

(分支支持强度(Bootstrap values)<50的未显示. 括号内为菌株序列号，分支上的数字为自展支持率，标尺为进化距离。)

以上结果表明,YJQ-30、YJQ-53、YJQ-40、JCHL-0209、JCHL-0207和LMJ-17这六株菌确定为枯草芽孢杆菌,CY-1、YJQ-69和WI-252确定为腊样芽孢杆菌,YJQ-52虽然位于枯草芽孢杆菌分支中,但其16s rRNA基因序列与已公布的特基拉芽孢杆菌KC851837极为相似,这需要通过进一步的实验验证.

3 结论

红树林是目前世界上少有的几个物种多样化的生态系统之一,因为其含有丰富的营养物质,对细菌的生长和繁殖来说是一个非常理想的环境,是细菌理想的栖息地[1-3].红树林因其独特的生长环境孕育出了丰富并具有特色的微生物资源,细菌是其微生物生态系统中的主要类群,而芽孢杆菌为细菌的优势种,因而红树林中潜藏着丰富的芽孢杆菌类群[11-13].本研究从红树林根际土壤中分离及纯化出19株芽孢杆菌,其中有10株具有产三种酶的能力,所占比例为52.6%,这说明在红树林生态系统中存在较多的具有丰富酶系的芽孢杆菌菌株,其蕴含的微生物资源需值得重视.

目前,对细菌的分类学鉴定主要以传统的细菌分类学方法为主,即以形态结构特征和生化等表型特征为依据.随着一些特殊微生物菌株的分离和发现,偏向于主观的传统分类方法存在诸多的不足,而分子生物学最大的特点就是能对进化上相对保守的核苷酸序列进行分析,这从分子水平弥补和克服了传统方法的主观片面性,增加了对微生物菌株鉴定的准确性[14-15].本研究通过对红树林生态系统中植物根际土壤的芽孢杆菌进行分离和纯化,参考常规生理生化特征对分离出来的菌株进行了初步判断,获取了10株疑似枯草芽孢杆菌,但系统发育分析表明,菌株CY-1、YJQ-69和WI-252与腊样芽孢杆菌更为接近,而YJQ-52菌株与特基拉芽孢杆菌接近程度最高.造成这一现象的原因有两点:一是腊样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌三个种的生化及形态特征较为相似,主观判断很难将其区分开来,这需要进一步使用分子手段进行16s rRNA基因分析才能最终确定其种属;二是特基拉芽孢杆菌是一类特殊种,其与枯草芽孢杆菌的相似性高于99%,生化特征也极为相似,这需要结合进一步的分子实验(如DNA杂交、功能基因比对、指纹图谱等)加以区别和判断.

枯草芽孢杆菌在工业、农业、医药、食品等领域具有广泛的应用价值,这主要归功于其丰富的酶系和较高的环境抗逆性.因此,筛选和鉴定出高产酶枯草芽孢杆菌是其应用于生产实践的前提.本研究利用生理生化分析结合16s rRNA基因序列分析的方法准确地从红树林生态系统中筛选出5株产三种酶的枯草芽孢杆菌,其中JCHL-0207、JCHL-0209和LMJ-17三株菌的产淀粉酶、纤维素酶和蛋白酶能力的表现较为显著,而JCHL-0207的产酶综合能力最高,其可以在水产养殖中用来高效转化饲料中的淀粉、蛋白质和纤维素,这为今后将其应用于生产实践提供了重要的理论依据.

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Isolation and Identification of Three Enzymes Producing Bacillus Subtilis from the Rhizosphere Soil of Mangrove Trees

MA Jun1,MA Rui1, YE Jia-qi1, LI Qi-lin1, JIANG Fang-yan1, QU Jiang-yong1,2

(1. College of Tropical Biology and Agronomy, Qiongzhou University, Sanya Hainan, 572022, China; 2. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai Shandong， 264005, China)

The Bacillus strains which were separated and purificated from mangrove rhizosphere soil were measured by biochemical methods and enzyme producing ability analysis, and in eight strains were simultaneously detected the enzyme producing ability of amylase, cellulase and protease. In these multi-enzyme producing bacteria, three strains (JCHL-0209, JCHL-0207 and LMJ-17) had high enzyme production capacity, whereas especially the enzyme production capacity of the strain (JCHL-0207) was the most significant. According to the 16s rRNA gene sequence analysis, these strains (JCHL-0209, JCHL-0207 and LMJ-17) are both determined as Bacillus subtilis, which is used as the basis of productive practice.

Mangroves;bacillus subtilis;enzyme producing;16s rRNA

2015-06-08

琼州学院校级青年科学基金(QYQN201323)；三亚院地合作项目(2013YD27,2014YD37)

马军(1982-),男,甘肃兰州人，琼州学院热带生物与农学院讲师,博士,研究方向为海洋微生物学.

S668.4

A

1008-6722(2015) 05-0061-06

10.13307/j.issn.1008-6722．2015．05．14