黄 方，潘学谊，王 宏，刘亚楠，关则兵，郭 煜，李铭杰，曾文彬，徐之龙（广东药学院附属第一医院血液科，广州510080）

凝血系统在肿瘤转移和血栓形成中发挥重要作用。蛋白质Z（protein Z，PZ）作为蛋白质Z依赖的蛋白酶抑制剂（protein Z－dependent protease inhibitor，ZPI）的辅因子，主要在ZPI抑制FⅩa的过程中发挥间接抗凝作用。有研究发现PZ血浆水平随着肿瘤病程进展而明显下降，其下降可能是导致恶性肿瘤高凝状态形成的一个新的机制，并可能成为恶性肿瘤预后不良因素之一［1－2］。最新研究发现PZ可以在乳腺癌细胞、肺癌细胞和结肠癌细胞中过表达或合成［3－5］，提示PZ与肿瘤之间可能存在着更深层的关系。本研究以免疫组织化学法及Western blot方法观察人肺腺癌组织和正常肺组织中PZ的表达水平，结合临床资料分析PZ与肺腺癌之间的关系，为肿瘤的早期诊断和治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选择2008～2011年在本院接受手术治疗的肺腺癌患者88例，肺大泡、炎性假瘤患者（非肿瘤）22例作正常肺组织对照组。66例为肺腺癌标本，其中男34例，女32例，年龄27～82岁，平均59岁。TNM分期（2009年AJCC标准，第7版）：将肺腺癌组织分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期；其中，0期8例，Ⅰ期14例，Ⅱ期26例，Ⅲ期8例，Ⅳ期8例。并将0～Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期分别分为早、中、晚期。低中分化32例，高分化34例。所有研究对象均对该研究项目知情同意，并获得人类伦理协会许可。正常肺组织离体后，立即剔除坏死部分，将组织脱水、渗透后石蜡包埋。肺腺癌标本离体后立即在肿瘤中心及边缘部位取材，留取肺腺癌组织及周围正常组织，尽量剔除坏死部分，分两部分保存：一部分将组织脱水、渗透后石蜡包埋；另外一部分于液氮中浸置30min，转至－80℃冰箱保存。所有病例术前均未放、化疗并经术后病理学检查确认，且排除患有其他肿瘤、严重肝病、2周内抗凝血及抗纤溶止血药物治疗、1个月内有手术史、创伤史及合并感染史的患者。

1．2 主要试剂 鼠抗人PZ单克隆抗体（美国Lifespan公司），actin抗体（Abcam公司），碱性磷酸酶标记山羊抗鼠IgG（KPL公司），PVDF膜（Millipore公司）。

1．3 方法

1．3．1 免疫组织化学法检测 按免疫组织化学法SP试剂盒说明书操作。冰冻组织标本复融，10%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，4μm厚连续切片。高压锅修复抗原，一抗为鼠抗人PZ单克隆抗体（1∶1 600），二抗为碱性磷酸酶标记山羊抗鼠IgG（1∶5 000），DAB显色。PZ阳性表达物质定位于细胞质，胞质内出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。其中，不着色为阴性（－），淡棕黄色为弱阳性（＋），深棕黄色为强阳性（＋＋＋），介于弱阳性与强阳性之间为中度阳性（＋＋）。用13点评分法进行评分：（1）0～4分判定阳性细胞的百分比：没有阳性细胞记为0分；阳性细胞百分比小于10%记为1分；＞10%～＜50%记为2分；＜80%记为3分；＞80%记为4分。（2）染色强度按阴性及弱、中、强阳性分别评0～3分。（3）最终的评分为2个指标的乘积。

1．3．2 Western blot检测 冰冻组织标本块裂解并超声匀浆，低温超速离心，BCA法测定蛋白浓度，10%SDS－PAGE凝胶电泳后转膜，一抗（1∶2 500）4℃孵育过夜，碱性磷酸酶标记二抗（1∶20 000）室温孵育2h，NBT／BCIP显色；因组织蛋白有限，内参actin欠齐，根据IPP软件计算PZ与actin表达的灰度值，采用PZ／actin值做统计分析。

1．4 统计学处理 采用SSPS17．0统计软件进行分析处理，计量资料以x±s表示，采用t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 免疫组织化学法检测人肺组织标本中PZ的表达情况PZ蛋白表达于细胞质，在肺腺癌细胞中高表达，在肺腺癌旁组织和正常肺组织中的肺上皮细胞不表达（图1）；PZ蛋白同样在肿瘤相关巨噬细胞（tumor－associated macrophages，TAMs）和新生血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）中表达（图1A），这与Sierko等［4］研究结果一致。本研究也可以看到PZ蛋白在正常肺组织中的巨噬细胞及ECs中表达（图1C）。

本研究进行了22例正常肺组织、66例肺腺癌旁组织及66例肺腺癌组织PZ蛋白表达水平的临床资料统计分析（表1），结果显示：PZ在肺腺癌组织的表达水平明显增加，与肺腺癌旁组织及正常肺组织比较，差异有统计学意义（P＜0．01），肺腺癌旁组织与正常肺组织PZ表达水平比较差异无统计学意义（P＞0．05）；肺腺癌早期与中期、晚期比较，PZ表达水平随肿瘤的进展明显增高（P＜0．01），但肺腺癌中期、晚期间PZ表达水平比较差异无统计学意义（P＞0．05）；肺腺癌低分化组与中分化组、高分化组比较，PZ表达水平明显增高，差异有统计学意义（P＜0．01）；肺腺癌女性组与男性组PZ表达水平比较差异无统计学意义（P＞0．05）。

图1 PZ在人肺组织中的表达情况

表1 PZ在人肺组织的表达情况与临床资料分析（x±s）

2．2 Western blot检测人肺组织PZ的表达情况 PZ在肺腺癌组织的表达水平明显高于肺腺癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0．05）；肺腺癌在早期、中期、晚期间比较，PZ表达随肿瘤进展明显增高（P＜0．05）；肺腺癌低分化组与中、高分化组间比较PZ表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0．05）；肺腺癌女性组与男性组PZ表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0．05），见表2、图2。肺腺癌1与癌旁1出自同一肺腺癌患者组织。

图2 人肺腺癌组织与肺腺癌旁组织中的PZ表达

表2 肺腺癌PZ／actin比值表达情况比较（x±s）

3 讨 论

PZ是1977年发现的一种新的维生素K依赖性糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员。其结构与其他一些丝氨酸蛋白酶（如凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ）及抗凝蛋白（尤其是凝血因子Ⅺ、蛋白C和蛋白S）具有高度的同源性。在ZPI抑制FⅩa的作用中，PZ作为一种辅助因子使ZPI对FⅩa的抑制作用增强1 000倍以上［6］。PZ在临床上研究较广泛，在血栓性疾病、妇产科疾病、炎性疾病等疾病中起着重要的生物学作用。

凝血系统在肿瘤转移和血栓形成中发挥重要作用。目前，关于PZ与肿瘤关系的报道国内外均不多，而且意见不一。Bolkun等［7］在多发性骨髓瘤的研究中认为，PZ低血浆水平可能增加多发性骨髓瘤血栓形成的风险，并与其分期、临床疗效相关。Galar等［8］对急性白血病的研究后认为PZ缺乏与急性髓系细胞白血病严重程度相关。作者前期临床研究［1－2］也发现PZ血浆水平随着恶性实体瘤病程进展而明显下降，其下降可能是导致恶性肿瘤高凝状态形成的一个新的机制。因此，PZ血浆水平下降可能是恶性肿瘤预后不良因素之一。Cankal等［9］在儿童急性淋巴细胞白血病诱导治疗期的研究中，发现治疗期间PZ血浆水平有明显下降，但并不会导致症状性出血或血栓形成。在PZ的基因多态性方面，有学者认为13A／G、G79A基因多态性不是肿瘤患者静脉血栓形成的危险因素［10－11］。Sierko等［3－5］发 现 PZ 可以在乳腺 癌细胞、肺 癌 细 胞和结肠癌细胞中过表达或合成，提示PZ与肿瘤之间可能存在着更深层的关系。同时，他们发现在癌组织中的TAMs和新生血管的ECs检测到PZ的表达，并进一步研究了非小细胞型肺癌及结肠癌组织中PZ、ZPI、凝血活化标志物凝血酶原片段（F1＋2）及纤维蛋白的表达及其相互关系［4－5］，认为PZ可能其在肿瘤位点（或肿瘤组织内）发挥抗凝血作用，从而可能影响到肿瘤的血管新生、侵袭和转移［3－5］。

为了求证这种关系，并探索PZ在肿瘤细胞的过表达除了可能与肿瘤凝血事件相关之外，是否也意味着与肿瘤发生、发展及转移相关，本研究选用了肺癌类型中最易早期转移及血栓形成的肺腺癌作为研究对象，采用免疫组织化学方法分别检测了22例正常肺组织、66例肺腺癌旁组织及66例肺腺癌组织中PZ的表达，发现PZ蛋白表达位于细胞质，PZ在肺腺癌组织的表达明显增加，与肺腺癌旁组织及正常肺组织比较，差异有统计学意义（P＜0．01），这与Sierko等［4］研究结果一致，提示PZ可能与肿瘤的发病相关；同时，在TAMs和新生血管ECs检测到PZ蛋白表达（图1），结合既往研究［3－5］，提示PZ可能与肿瘤的抗凝血作用相关，可能会影响到肿瘤的进展、转移和侵袭。

为进一步了解PZ蛋白在肺腺癌的表达情况，本研究采用Western blot方法分别检测66例肺腺癌旁组织及66例肺腺癌组织中PZ蛋白的表达，并通过对免疫组织化学法及Western blot方法检测PZ蛋白的表达情况进行统计分析，结果均显示PZ在肺腺癌组织中的表达明显高于肺腺癌旁组织（P＜0．05，表1、2）。因此，认为PZ蛋白确实在肺腺癌组织中过表达。前期研究［1－2］中PZ血浆水平在恶性实体瘤中降低，可见PZ蛋白在肺腺癌组织与血浆的表达水平不一致，目前国内外暂无相关研究报道。推测原因可能为：（1）肺腺癌组织中的PZ蛋白主要表达在肺腺癌细胞，即PZ可能作为癌基因在肺腺癌细胞中合成分泌，与肿瘤的发病相关。而肿瘤细胞合成分泌的PZ蛋白，可能同时在肿瘤组织内或肿瘤位点发挥抗凝血作用而被消耗，也可能不能通过肺腺癌细胞的细胞膜而未能释放到血浆中，从而未能引起血浆水平的升高。（2）尽管PZ可能在肺腺癌细胞中合成分泌，血浆中的PZ仍主要由肝脏合成分泌，在肿瘤凝血事件中发挥作用，PZ血浆水平越低，越容易形成血栓［7－8］。（3）目前，引起肿瘤中PZ血浆水平降低的原因仍未明确，而恶性肿瘤是高凝状态的常见病理过程，且越接近肿瘤晚期，凝血异常事件越高，同时消耗着凝血相关因子（包括PZ），进而PZ血浆水平可能随着恶性实体瘤病程进展而下降，而这种肿瘤高凝状态同时也可能刺激PZ进入肿瘤细胞中，在肿瘤组织内或肿瘤位点发挥抗凝血作用。

同时，为探讨PZ与肿瘤发病及进展的关系，作者首次对检测的结果进行了分期、分化和性别的临床资料分析。发现PZ蛋白在中、晚期肺腺癌组的表达明显高于早期肺腺癌组（P＜0．01，表1、2），推测其表达可能与肺腺癌的分期相关，即肺腺癌越接近晚期，PZ表达可能越高。但在中、晚分期肺腺癌组织的表达中，Western blot方法与免疫组织化学方法得出结论不一致（表1、2），作者分析原因可能如下：（1）Western bolt方法检测的是肺组织的总蛋白，除了包含肺腺癌细胞及正常肺上皮细胞的蛋白，还有血液及肺间质细胞等多种蛋白成分，因此，这些因素可能在一定程度上影响了Western blot方法的检测结果。（2）目前，统计数量仍较小，也有可能存在统计误差。（3）肿瘤病理生理环境是复杂的，存在许多特殊的基因及作用机理，晚期肺腺癌患者多合并凝血障碍，也有可能会促使癌细胞内的PZ分泌到细胞外，与ZPI结合起抗凝血作用，因此，肿瘤后期癌细胞内的PZ可能会减少。究竟PZ表达是否与肺腺癌的进展或凝血异常相关，仍需要进一步研究。

在肿瘤分化的统计分析中，结果显示PZ蛋白在低分化组的表达明显高于中高分化组（P＜0．01），表明其表达可能与肺腺癌的分化程度密切相关（表1、2）。众所周知，低分化的肺腺癌恶性度高，预后较差，推测PZ表达可能与肺腺癌的恶性程度正相关，即肺腺癌分化程度越低，恶性程度越高，预后越差，PZ表达可能越高。而PZ在性别组的统计分析中，PZ的表达在女性组与男性组间比较，差异无统计学意义（P＞0．05），可能表明PZ在肺腺癌的表达无性别差异（表1、2）。综上所述，作者推测PZ在肺腺癌高表达可能参与了肺腺癌的发生及进展过程，可能是肿瘤恶性程度及预后的一个重要指标，也可能在肿瘤的转移与血栓形成中发挥一定的作用。

寻找肿瘤发生、转移过程中起作用的未知新基因，阐明肿瘤发生与转移机理是目前肿瘤分子生物学研究的热点。PZ在肿瘤细胞中的高表达究竟是在肿瘤位点发生了抗凝血作用引起的？还是本来肿瘤细胞中就分泌表达PZ，而对肿瘤的高凝状态起保护作用？或是在肿瘤的发生、进展、侵袭及转移中起作用？对PZ的进一步深入研究有可能为人类恶性肿瘤的预防和治疗方法提供新的思路。

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