逯岭松，刘 蓓，马 霄，虞 成，吴 舜，冷建杭△

（1．浙江省杭州市第一人民医院中心实验室 310006；2．浙江大学医学院

附属妇产科医院生殖遗传科，浙江杭州310006）

髓过氧化物酶（MPO）是由活化中性粒细胞、单核细胞及组织巨噬细胞颗粒释放的一种含血红素的过氧化物酶［1］。大量研究发现，血清MPO能在未发生心肌坏死的情况下预测不良心脏事件的危险性及在随后的1～6个月内发生严重心血管疾病的危险性，是心血管疾病风险的独立预测因子［2－3］。因此，MPO的检测在心血管疾病的早期临床诊断中起着重要的作用。目前，MPO的常规检测方法，如放射免疫分析法和酶联免疫吸附试验（ELISA），具有一定的灵敏度和特异性，但是操作繁琐、耗时，需要精密的仪器和专业人员。针对以上不足，本研究通过将MPO抗体固定在石墨化多孔碳－金纳米粒子（AuNPs＠GMCs）复合材料修饰的玻碳电极表面，研制了一种MPO电化学免疫传感器，并对传感器的性能进行评价，现报道如下。

1 材料与方法

1．1 试剂 MPO抗原、MPO抗体、牛血清清蛋白（BSA，96%～99%）、壳聚糖（CS）、氯金酸、石墨化多孔碳（GMCs，球体直径330nm，孔径137埃）购买于美国Sigma公司。人髓过氧化物酶ELISA试剂盒购买于上海沪峰生物科技有限公司。1，6－己二硫醇［HS（CH2）6SH，97%］购买于上海生工生物有限公司。实验所用缓冲液均为含5mmol／L ［Fe（CN）6］3－／4－和0．1 mol／L KCl的0．1mol／L PBS溶液（pH 7．0），实验用水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

1．2 仪器 CHI 6043D电化学工作站，玻碳电极（GC，工作电极），铂丝（对电极），Ag／AgCl电极（参比电极），LIBROR AEL－200电子天平，BRANSON B3200S－T恒温超声仪，BIORAD全自动酶免分析仪。

1．3 实验方法

1．3．1 纳米金（AuNPs）的制备 采用经典柠檬酸钠还原法制备AuNPs溶液，并用透射电子显微镜对其进行表征。

1．3．2 GMCs包裹的纳米金悬液（AuNPs＠GMCs）的制备将适量GMCs置于含2mmol／L HS（CH2）6SH 的乙醇溶液中，室温24h以上，使其表面富含巯基（－SH）。用乙醇和双蒸水反复清洗预处理后的GMCs并用氮气干燥，然后将富含－SH的GMCs粉末置于AuNPs溶液中10h，使其通过－SH吸附AuNPs。随后用吸管尽可能多地吸掉上清液，去除未结合的AuNPs，使用双蒸水清洗，氮气下干燥后即制得AuNPs＠GMCs粉末。将壳聚糖粉末置于1．0%（v／v）的醋酸溶液中，室温超声30min后制得0．5mg／mL的壳聚糖溶液。然后将AuNPs＠GMCs粉末加入到0．5mg／mL的壳聚糖溶液中超声后得到2．0mg／mL黑色AuNPs＠GMCs悬液。

1．3．3 MPO免疫传感器的制作 玻碳电极经0．3μm、0．05 μm铝粉抛光至镜面以充分去除电极表面的杂质，依次置于双蒸水、乙醇、双蒸水中超声清洗5min，晾干待用。将5μL的AuNPs＠GMCs悬液滴涂于预处理的玻碳电极表面，室温晾干，置于MPO溶液中于4℃过夜。最后在室温下将电极浸入2．5g／L的BSA溶液中1h，以封闭电极上的非特异性吸附位点，制成MPO电化学免疫传感器，4℃下保存备用。该传感器的制作流程如图1所示。

图1 MPO电化学免疫传感器的制作流程

1．4 检测方法 在三电极体系下，将制备好的免疫传感器置于含5mmol／L［Fe（CN）6］3－／4－和0．1mol／L KCl的0．1mol／L PBS溶液（pH 7．0）中，记录电极稳定时的空白电流值I0。按照一定的比例稀释MPO标准品，配成不同浓度的MPO标准溶液，将修饰电极置于不同浓度的MPO标准溶液中37℃反应20min后，再在工作溶液中进行差分脉冲伏安测试，记录稳定后的电流值I1。根据不同浓度的MPO所对应的电流差值ΔI（ΔI＝I0－I1）绘制标准曲线。

1．5 酶联免疫吸附试验（ELISA） 采用商品化人 MPO ELISA试剂盒严格按照试剂盒说明书操作步骤对25例血清样品（来自杭州市第一人民医院）进行检测。

2 结 果

2．1 AuNPs＠GMCs复合纳米材料的表征 通过透射电子显微镜对AuNPs＠GMCs进行表征，结果如图2所示。GMCs呈三维有序球形多孔结构，AuNPs分散较好，平均直径为20 nm，均匀吸附在GMCs上。

2．2 实验条件优化 本实验分别对检测溶液的pH、免疫反应温度和时间进行了优化。从图3可以看出，当工作溶液的pH达到7．0、孵育温度为37℃、孵育20min时，传感器的性能达到最佳状态。

图2 透射电镜图像

图3 实验条件

2．3 标准曲线 配置300．000、100．000、50．000、25．000、12．500、6．250、3．125、2．000ng／mL 8个不同浓度的 MPO 标准溶液，使用制备好的传感器对其进行检测，分别记录电流变化值ΔI，绘制标准曲线（图4）。结果表明，MPO浓度在2．000～300．000ng／mL范围内与ΔI成良好的线性关系，线性方程为：Y＝12．980＋0．234 X，线性相关系数r＝0．999。将传感器在空白溶液中连续扫描10次，根据3倍空白标准差与斜率的比值得出其检出限为0．5ng／mL。

图4 MPO浓度与峰电流的线性关系

2．4 临床应用 使用本实验制备好的MPO电化学免疫传感器检测了25例临床血清标本，同时采用标准ELISA法进行平行试验。图5为两种方法检测结果的相关性分析，由图可知，两种方法检测结果的相关系数为0．983（y＝2．711＋0．977x。

x：ELISA；y：免疫传感器）。

图5 电化学免疫传感器与ELISA法血清样本检测结果相关性分析

3 讨 论

电化学免疫传感器将电化学检测技术和抗原抗体特异性反应原理结合在一起，通过将生物反应信号转化为电化学信号，可实现对靶物质的定量检测。与传统的免疫分析技术比较，电化学免疫传感器不仅具有免疫反应的高特异性，而且结合了电化学检测技术的高灵敏性。由于电化学免疫传感器具有便携、成本低、操作方便、反应时间短等优势，使其备受关注并在疾病标志物检测领域得到广泛应用［4－5］。目前，将电化学免疫传感器应用于MPO检测的报道尚不多见［6－9］。

制备免疫传感器的关键问题：（1）如何保持抗体在电极表面的活性？因为这不仅关系到检测结果的可靠性，还会影响传感器的再生能力。MPO抗体作为一种蛋白质，只有在具有良好生物相容性的环境中才能最大地保持其生物活性。由于AuNPs具有较大的比表面积、良好的生物相容性及较高的表面自由能，使其不仅能够牢固地吸附抗体、增大抗体的负载量，而且能够保持抗体的活性［10－12］。（2）如何放大检测信号，提高电流响应？这将直接影响传感器的检测灵敏度。GMCs具有较强的电子传导能力、石墨样结构及有效的吸附和去吸附能力等优点［13－15］，能够极大地放大电流信号，提高免疫传感器的检测灵敏度。

本实验采用AuNPs＠GMCs复合纳米材料修饰电极，一方面可以保持MPO抗体的活性，另一方面可以促进电子传递，极大地提高电流响应，增加检测灵敏度。为了使传感器发挥最佳性能，本实验对检测条件进行了优化。从图3可知，当工作溶液的pH为7．0时，免疫传感器在37℃环境下和抗原溶液一起孵育20min时，传感器的电流响应最大。在最优实验条件下，该电化学免疫传感器对MPO响应良好，表现出较宽的检测范围。MPO浓度在2．000～300．000ng／mL范围内与ΔI呈现良好的线性关系，线性相关系数达到0．999，且该传感器检出限较低，可以达到0．500ng／mL，说明该传感器的灵敏度较高。另外，本实验使用制备好的MPO电化学免疫传感器检测了25例临床血清标本，并与标准ELISA进行相关性分析。由图5可知，2种方法检测结果的相关系数为0．983，结果令人满意。

综上所述，本实验制备的电化学免疫传感器具有良好的性能，在检测MPO方面表现出较宽的线性范围和较低的检出限，可实现MPO的超灵敏检测，对心血管疾病患者的早期诊断具有重要的意义。

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