成 力，李小庆，陈文江，陈 灿

（1．广东医学院研究生学院，广东湛江524023；2．第三军医大学新桥医院心血管内科，重庆400037；3．广东医学院附属医院心血管内科，广东湛江524001）

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是一种临床越来越常见的病理生理综合征，主要累及肺小动脉，并使肺血管阻力增加，血管病变，是继冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压之后的第3个常见的心血管疾病，其特征性病理改变主要是中膜肥厚、内膜增殖和闭塞、血栓形成、血管肌化、血管收缩、外膜增厚、血管及周围炎症细胞浸润等。其病因复杂，可由单一或多种心脏、肺部或肺血管疾病引起，其临床特征为右心室后负荷增加，严重者可因右心衰竭而死亡。其发病机制可能与遗传、药物毒性、内皮细胞功能障碍、血栓形成等有关，但还有待进一步研究［1］。最近研究证实一部分微小RNA（microRNA，miRNA）可能与PH 发病机制有关，如 miRNA－1、miRNA－21、miRNA－34、miRNA－133、miRNA－204、miRNA－208 等［2－5］都 可能参与了PH的发病及病理生理过程。miRNA－126－3p存在于哺乳动物内血管丰富的组织中，是一种内皮细胞特异性表达miRNA，主要调控内皮细胞的生物合成、血管发育和维持血管的完整性，是血管生成的关键调节因子［6－8］。而动脉性肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）的发病机制主要与内皮细胞功能障碍有关［9－11］。因此，本研究设想 miRNA－126－3p与先天性心脏病导致的PH有关，从基因、蛋白等水平对miRNA－126－3p与先天性心脏病导致的PH的发病机制进行研究。

1 资料与方法

1．1 一般资料 选取2014年1月至2015年1月入院的先天性心脏病患者25例作为研究对象，其中，PH患者11例（PH组），非PH患者14例（对照组）。患者入院后进行右心导管检查测压。25例患者均取肺组织进行病理检查，心外科行手术治疗取下组织后，留取少量组织于－80℃冰箱内冻存，以备后续实验。两组患者年龄比较差异无统计学意义（P＞0．05），且两组患者在性别、病史、生化检查结果方面比较差异无统计学意义，而肺动脉压力方面比较差异有统计学意义（P＜0．000 1），PH组患者肺动脉压力最小为30mm Hg，最大为45 mm Hg，而对照组患者肺动脉压力全部小于25mm Hg。两组患者一般资料比较见表1。

表1 两组患者一般资料比较

1．2 miRNA实时荧光定量检测 miRNA提取（miRcute miRNA提取分离试剂盒，DP501）、逆转录（miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒，KR201）、荧光定量（miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒SYBR Green，FP401）、miRNA－126－3p（UCG UAC CGU GAG UAA UAA UGC G）荧光定量上游引物（hsa－miR－126－3p qPCR Primer，CD201－0058）、下游通用引物等试剂盒均由广州真知生物有限公司提供，实验方法皆按照试剂盒说明书进行。荧光定量检测步骤：94℃变性2min；PCR循环中模板94℃变性20s；60℃退火、延伸34s；共30个循环，U6为内参。本研究采用2－ΔCt相对定量方法对数据进行分析：ΔCt（PH组）＝Ct（实验组目标基因）－Ct（实验组内参基因）；ΔCt（对照组）＝Ct（对照组目标基因）－Ct（对照组内参）。

1．3 miRNA－126－3p生物信息学预测 采用生物信息学软件starBase［12－13］（http：／／starbase．sysu．edu．cn）预测 miRNA－126－3p的生物学功能、靶基因、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路和其长链非编码 RNA（long non－coding，lncRNA）、竞争性内源 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）、环状 RNA（circular RNA，circRNA）。

1．4 qRT－PCR 首先，用 TRIZOL试剂（Invitrogen，美国）按照说明书提取所获取肺组织的总RNA，按照逆转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司）说明书将所提取RNA进行逆转录，然后按照实时荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司）说明书进行荧光定量：95℃预变性30s；95℃扩增、延伸15s；60℃退火30s；共40个循环。血管内皮生长A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）PCR引物由英潍捷基上海贸易有限公司合成。其上游引物：AAT CCC GGT ATA AGT CCT G，下游引物：AAA TGC TTT CTC CGC TCT，产物片段大小为112kb，以β－actin作为内参。采用2－ΔCt相对定量方法进行数据分析：ΔCt（实验组）＝Ct（实验组目标基因）－Ct（实验组内参基因）；ΔCt（对照组）＝Ct（对照组目标基因）－Ct（对照组内参）。

1．5 Western blot检测 首先，将所获取的组织取约50mg提取其蛋白质，采用BCA法测量其蛋白浓度，继而进行蛋白电泳、转膜、VEGFA一抗（购自武汉博士德生物有限公司）孵育、二抗孵育、杂交、显影、曝光。VEGFA稀释比例1∶400，内参选用β－actin（稀释比例1∶1 000，购自武汉博士德生物有限公司），其余相关试剂和材料均购自碧云天生物技术研究所。结果分析用Image J图像分析软件计算条带灰度值，最后结果为目的条带灰度值／内参条带灰度值。

1．6 统计学处理 采用GraphPad Prism 5（GraphPad Software Inc，CA，USA）进行数据分析，所有定性资料采用χ2检验或Fisher检验；计量资料采用x±s表示，采用t检验进行分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2．1 肺组织中miRNA－126－3p实时荧光定量结果 经过肺组织miRNA提取、逆转录，并行实时荧光定量检测，发现PH组miRNA－126－3p的表达水平（0．325 8±0．028）与对照组（0．036±0．009）比较差异有统计学意义（P＜0．01），见图1。

图1 miRNA－126－3p实时荧光定量结果分析

图1 miRNA－126－3p实时荧光定量结果分析

2．2 miRNA－126－3p生物信息学分析 采用starBase生物信息学软件预测miRNA－126－3p的生物学功能、靶基因及KEGG信号通路，见表2。从预测结果可知：miRNA－126－3p的生物学功能主要与结合蛋白、信号转导、细胞分化、调控细胞形态、调控MAPK和胰岛素受体信号通路等有关；其KEGG信号通路主要是胰岛素受体信号通路和Jak－STAT 信号通路；PANTHER预测其主要功能是促进血管生成。miRNA－126－3p靶基因（至少有2个在线软件得到同一结果，共73个预测靶基因）主要有：VEGFA、SPRED1、PIK3R2、PARP16、TNFRSF11B、ADAM9、SLC7A5、AKAP13等。结合其生物学功能及靶基因，本研究假定VEGFA为其靶基因，进行后续验证实验。

表2 miRNA－126－3p的KEGG信号通路预测

续表2 miRNA－126－3p的KEGG信号通路预测

2．3 VEGFA mRNA表达结果及相关性分析 提取两组患者肺组织的总RNA，然后进行逆转录及荧光定量检测VEGFA在两组样本的表达水平（图2A），PH组患者VEGFA的表达水平与对照组比较差异有统计学意义（P＜0．01）。miRNA－126－3p与VEGFA相关性分析发现，二者呈正相关（图2B），相关度为0．702 1，Pearson 相关系数为 0．837 9，95%CI 为（0．661 9～0．926 4），P＜0．000 1。

图2 VEGFA实时荧光定量结果分析及相关性分析

2．4 PH组与对照组肺组织VEGFA蛋白表达情况比较 对所收集患者的肺组织进行蛋白定量分析，结果提示PH组患者VEGFA蛋白的表达水平较对照组明显升高，见图3。

图3 两组患者肺组织VEGFA蛋白表达结果及定量统计分析

3讨 论

PH是临床越来越常见的一种疾病，其类型众多，而且其发病机制尚未明确。目前研究表明PH发病机制可能与遗传、血管内皮功能障碍、平滑肌细胞功能紊乱等有关。关于遗传机制，目前多认为骨形成蛋白Ⅱ型受体（BMPR2）、激活素受体样激酶1（ALK1）等基因可能通过遗传方式导致PH发生，而且主要是导致PAH的发生。目前，大多数研究较为认可的主要发病机制是各种原因导致的血管内皮功能障碍和（或）平滑肌细胞功能紊乱而导致PH发生［14］。miR－126－3p被认为是内皮细胞特异性表达miRNA，与血管生成等有关，可能参与血管内皮生长因子信号通路的调控［15－16］。本研究通过对PAH患者的miRNA水平、mRNA水平、蛋白等水平研究发现，先天性心脏病PH患者肺组织的miR－126－3p的表达较对照组有明显差异；通过对miR－126－3p的生物学功能及靶基因等预测发现，miR－126－3p可能参与血管形成，并调控靶基因VEGFA的表达；后续基因水平和蛋白水平试验发现PH组VEGFA的mRNA及蛋白都较对照组有明显差异。各水平研究表明，miR－126－3p可能通过调控VEGFA而导致PH的发生。

本研究只是miR－126－3p与PH发病机制的一个初步研究，其具体调控机制还有待后续细胞实验及动物实验等验证，而且本研究样本量较少，还有待大样本研究进行验证及筛选相关标志物。本研究在进行生物信息学分析时，还对miR－126－3p的ceRNA、circRNA、lncRNA都进行了分析，ceRNA可与miR－126－3p共同结合 miRNA 作用元件［17］，可以联合分析miRNA的具体作用机制；miRNA和circRNA由于其稳定、特异、高丰度的表达特性［18］，都可以作为疾病标志物研究，在先天性心脏病相关性PH研究可以相辅相成；lncRNA也可以作为标志物而进行相关研究［19］。分析发现 miR－126－3p的lncRNA为 XIST（X inactive specific transcript，non－protein coding），其circRNA 为PLXNB2（Plexin B2），其ceRNA有PLXNA3、FNDC3B、RBM33、SS18L1、ZNF326、CRAMP1L、ZNF292、YEATS2、NOM1、SIN3B、ZC3H11A、CPOX、ZSWIM4、BHLHE40、ZNF532、YOD1、SLC2A3、USP31。如果后续研究从ceRNA、circRNA、lncRNA、基因、蛋白等多个水平进行研究，可以为PH的发病机制进行详细阐述，为其实验研究和临床诊治提供理论支持。

［1]Paulin R，Michelakis ED．The metabolic theory of pulmonary arterial hypertension［J］．Circ Res，2014，115（1）：148－164．

［2]Potus F，Graydon C，Provencher S，et al．Vascular remodeling process in pulmonary arterial hypertension，with focus on miR－204and miR－126 （2013Grover Conference series）［J］．Pulm Circ，2014，4（2）：175－184．

［3]Wang S，Aurora AB，Johnson BA，et al．The endothelialspecific microRNA miR－126governs vascular integrity and angiogenesis［J］．Dev Cell，2008，15（2）：261－271．

［4]Urbich C，Kuehbacher A，Dimmeler S．Role of microRNAs in vascular diseases，inflammation，and angiogenesis［J］．Cardiovasc Res，2008，79（4）：581－588．

［5]Lei W，Li G，Zheng J，et al．Roles of microRNA in vascular diseases in cardiac and pulmonary systems［J］．Pharmazie，2014，69（9）：643－647．

［6]Fish JE，Santoro MM，Morton SU，et al．miR－126regulates angiogenic signaling and vascular integrity［J］．Dev Cell，2008，15（2）：272－284．

［7]Kim GH，Ryan JJ，Marsboom G，et al．Epigenetic mechanisms of pulmonary hypertension［J］．Pulm Circ，2011，1（3）：347－356．

［8]Ge HY，Han ZJ，Tian P，et al．VEGFA expression is inhibited by Arsenic trioxide in HUVECs through the upregulation of Ets－2and miRNA－126［J］．PLoS One，2015，10（8）：e0135795．

［9]Zhang HD，Zhang R，Jiang X，et al．Effects of oral treatments on clinical outcomes in pulmonary arterial hypertension：a systematic review and meta－analysis［J］．Am Heart J，2015，170（1）：96－103．

［10］Parikh KK．Use of outcome measures in pulmonary hypertension clinical trials［J］．Am Heart J，2015，170（3）：419－429．

［11］Vaidya B，Gupta V．Novel therapeutic approaches for pulmonary arterial hypertension：Unique molecular targets to site－specific drug delivery［J］．J Control Release，2015，211（1）：118－133．

［12］Li JH，Liu S，Zhou H，et al．starBase v2．0：decoding miRNA－ceRNA，miRNA－ncRNA and protein－RNA interaction networks from large－scale CLIP－Seq data［J］．Nucleic Acids Res，2014，42（Database issue）：D92－D97．

［13］Yang JH，Li JH，Shao P，et al．starBase：a database for exploring microRNA－mRNA interaction maps from argonaute CLIP－Seq and Degradome－Seq data［J］．Nucleic Acids Res，2011，39（Database issue）：D202－D209．

［14］Bienertova－Vasku J，Novak J，Vasku A．MicroRNAs in pulmonary arterial hypertension：pathogenesis，diagnosis and treatment［J］．J Am Soc Hypertens，2015，9（3）：221－234．

［15］Zhou G，Chen T，Raj JU．MicroRNAs in pulmonary arterial hypertension［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2015，52（2）：139－151．

［16］Meloche J，Pflieger A，Vaillancourt M，et al．miRNAs in PAH：biomarker，therapeutic target or both？［J］．Drug Discov Today，2014，19（8）：1264－1269．

［17］Salmena L，Poliseno L，Tay Y，et al．A ceRNA hypothesis：the Rosetta Stone of a hidden RNA language？［J］．Cell，2011，146（3）：353－358．

［18］Jeck WR，Sorrentino JA，Wang K，et al．Circular RNAs are abundant，conserved，and associated with ALU repeats［J］．RNA，2013，19（2）：141－157．

［19］Brosnan CA，Voinnet O．The long and the short of noncoding RNAs［J］．Curr Opin Cell Biol，2009，21（3）：416－425．