川芎嗪对脓毒症大鼠肝细胞线粒体体视学的影响

2015-03-14王锦权陶晓根张霖刘海华姚秀英张兴荣李坤LiWei黄业华

中国临床保健杂志 2015年4期

关键词：川芎嗪脓毒症线粒体

王锦权，陶晓根，张霖，刘海华，姚秀英，张兴荣，李坤，Li Wei，黄业华

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，a 南区重症医学科，b 肾内科，合肥 230001；2.UCL School of Pharmacy,University College London)

·基础研究·

川芎嗪对脓毒症大鼠肝细胞线粒体体视学的影响

王锦权1a，陶晓根1a，张霖1a，刘海华1a，姚秀英1a，张兴荣1a，李坤1a，Li Wei2，黄业华1b

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，a 南区重症医学科，b 肾内科，合肥 230001；2.UCL School of Pharmacy,University College London)

[摘要]目的研究川芎嗪(TMP)对脓毒症大鼠肝细胞线粒体结构的保护作用及可能机制。方法实验大鼠被分成对照组、脓毒症组、治疗组和预防组；用盲肠结扎穿孔法制备大鼠脓毒症实验模型，在术后10 h，取肝脏标本用JEM-1230透射电子显微镜观察肝细胞的超微结构，选用Image-Pro Plus 6.0图像软件对线粒体进行测量；用Western blot技术检测肝细胞线粒体内膜水通道蛋白(AQP)8的表达。结果和对照组比较，其余3组单个肝细胞切面的线粒体总数和数密度均减少(P<0.01)，但治疗组和预防组均多于脓毒症组(P<0.01)；线粒体体积密度脓毒症组也较对照组低(P<0.01)；线粒体内膜AQP8的相对表达量在脓毒症组、治疗组和预防组均较对照组明显减少(P<0.01)；治疗组和预防组的AQP8相对表达量较脓毒症组增多(P<0.01)。结论在脓毒症状态下，TMP可保护肝细胞线粒体的结构，可能是通过增加线粒体内膜AQP8表达而起作用的。

[关键词]脓毒症；线粒体,肝;川芎嗪；大鼠,Sprague-Dawley

Effects of tetramethylpyrazine on stereology of hepatocyte mitochondria in septic ratsWangJinquan*,TaoXiaogen,ZhangLin,LiuHaihua,YaoXiuying,ZhangXingrong,LiKun,WeiLi,HuangYehua(*ICU,SouthsideofAnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001，China)Correspondingauthor:HuangYehua,Email:yehua63@163.com

[Abstract]ObjectiveTo study the protective effects and plausible mechanisms of tetramethylpyrazine(TMP)on the structure of hepatocyte mitochondria in septic rats.MethodsThe rats were randomly divided into four groups:control group,septic group,therapeutic group and prevention group.The model of septic rat was established by the cecal ligation and puncture(CLP).The liver was taken out from septic rat 10 h after CLP,.The ultrastructure of hepatocyte were observed by the JEM-1230 transmission electron microscope.The hepatocyte mitochondria were measured by Image-Pro Plus 6.0 analysis software.The expression of AQP8 was assayed by Western blot.ResultsCompared with the control group,the total number of mitochondria and numberical density were fewer in other 3 groups.The total number of mitochondria and numberical density of septic group were more than the therapeutic and prevention group(P<0.01),but the volume density of septic group was lower than the control group(P<0.01).Compared with the control group,the relative AQP8 protein expression was significantly reduced in the other 3 groups(P<0.01).The AQP8 protein expression of the therapeutic and prevention group were higher than the septic group(P<0.01).ConclusionTMP can protect stereology of hepatocyte mitochondria in septicrats by increasing the expression of AQP8 protein.

[Key words]Sepsis;Mitochondria,liver;Tetramethylpyrazine；Rats,sprague-dawley

线粒体功能障碍和由此引起的细胞能量代谢衰竭是脓毒症介导多器官功能衰竭的主要病理机制之一[1]；肝细胞线粒体损伤可导致肝脏能量代谢和解毒、合成等功能障碍，并最终引起肝功能不全甚至衰竭[2]。对线粒体的保护和通过刺激线粒体生物发生(新蛋白转换)加速病情恢复是目前脓毒症研究的热点问题之一[3]。川芎嗪的有效成分是四甲基吡嗪(TMP)，研究证明TMP对脓毒症引起的急性肝损伤具有保护作用，可维持肝细胞结构的完整性[4]。本研究通过对脓毒症大鼠肝细胞线粒体的体视学研究，分析TMP对线粒体形态和线粒体内膜水通道蛋白(AQP)8表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物选择清洁级SD大鼠48只，雌雄各半，体质量160~200 g,由安徽医科大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK(皖)2005-001]。SD大鼠被随机分为4组，对照组、脓毒症组、治疗组和预防组；脓毒症大鼠模型使用盲肠结扎穿孔(CLP)法制备，脓毒症组大鼠仅进行CLP手术；治疗组大鼠在完成CLP术后，立即从尾静脉注射盐酸川芎嗪注射液(无锡市第七制药有限公司生产)，剂量为60 mg/kg[5]；预防组大鼠在尾静脉注射60 mg /kg盐酸川芎嗪注射液7 d后[6]，接受CLP术；对照组大鼠进行假手术。实验分2部分进行，第1部分，每组12只大鼠，每次实验从4组中各取1只，观察手术时间、手术结束至出现脓毒症的时间和实验动物存活时间。脓毒症诊断标准：肛温<36 ℃或>38 ℃、触摸大鼠的警觉性下降、腹泻、眼睛出血、立毛等[7]。第2部分，每组12只大鼠，每次实验从4组中各取1只，在CLP术后10 h，用苯巴比妥腹腔注射麻醉后处死实验大鼠，肝脏被快速取出置于0 ℃缓冲液中。

1.2线粒体的体视学观察依据体视学四级取样法[8]，于肝脏左中叶距下缘约0.5 cm处切取约1 mm3的肝组织10余块，常规2.5%的戊二醛固定后随机选取3块组织，经锇酸固定，逐级酒精脱水、包埋，制成50 nm超薄切片。经4%的醋酸铀酰和0.5%的醋酸铅双重染色后，用JEM-1230透射电子显微镜(日本电子株式会社)观察肝细胞线粒体的超微结构。对每只实验大鼠肝脏标本观察50个肝细胞，从中随机选取12个肝细胞电镜图片，放大5 000倍，计算每个肝细胞切面的线粒体总数；再放大10 000倍，分析计算每个肝细胞切面的线粒体数密度(Nv)、表面积密度(Sv)和体积密度(Vv)。Nv反映单位体积内线粒体的数量，Nv越大，表明线粒体数量越多； Sv反映单位体积内线粒体的表面积大小，与线粒体的数量、大小和形状有关； Vv反映单位体积细胞内线粒体体积，与线粒体的体积、数量和大小有关[9]。用Image-Pro Plus 6.0图像软件进行测量[10]。

1.3线粒体内膜AQP8蛋白检测[4]将肝组织剪碎，用电动匀浆器匀浆；使用差速离心法分离线粒体，线粒体用分离介质稀释后备用。制备线粒体的裂解液，用Western blot技术检测线粒体膜AQP8的相对表达量。AQP8相对表达量=AQP8条带灰度/β-肌动蛋白条带灰度×100%；再以对照组AQP8相对表达量为100%，余三组的AQP8蛋白相对表达量=各组实际AQP8蛋白相对表达量/对照组AQP8蛋白相对表达量×100%。用Image-pro Plus 6.0软件计算。

1.4统计学处理用SPSS17.0进行统计学分析，用独立样本t检验和单因素方差分析进行统计学处理。

2结果

2.1手术结束至出现脓毒症的时间和实验动物存活时间比较对照组大鼠存活时间均大于48 h；脓毒症组大鼠术后出现脓毒症的时间较治疗组和预防组的大鼠短(P<0.01)；治疗组和预防组大鼠的存活时间较脓毒症组大鼠长(P<0.01)；治疗组和预防组比较术后出现脓毒症的时间和存活时间差异均无统计学意义(P>0.05)。对照组大鼠手术时间较另三组明显缩短(P<0.01)，手术时间在脓毒症组、治疗组和预防组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　各组手术时间、术后出现脓毒症时间和存活时间

注：与对照组比较,aP<0.01;与脓毒症组比较,bP<0.01

2.2线粒体的体视学比较脓毒症状态下肝细胞线粒体形态发生了显著改变，线粒体体积增大，嵴肿胀明显、空泡样变，可见部分线粒体外膜破裂，发生脂肪变性(见图1)。和对照组比较，脓毒症组、治疗组和预防组的单个肝细胞切面线粒体总数和Nv均减少(P<0.01)，但治疗组和预防组均多于脓毒症组(P<0.01)；脓毒症组Vv也较对照组较少(P<0.01)，治疗组和预防组和对照组间差异无统计学意义(P>0.05)；但Sv各组间差异无统计学意义(P>0.05)，见图2，表2。

表2　肝细胞切面线粒体总数、Nv和Sv和Vv的比较

注：与对照组比较,aP<0.01;与脓毒症组比较,bP<0.01

2.3AQP8的表达线粒体内膜AQP8的相对表达量，和对照组相比，脓毒症组、治疗组及预防组明显减少(P<0.01)，治疗组和预防组较脓毒症组显著增多(P<0.01)，而治疗组和预防组之间差异无统计学意义(P>0.05),见图3。

3讨论

在脓毒症状态下，氧化与还原失衡和全身性炎性反应可引起进行性线粒体衰竭、能量耗竭、组织缺氧、感染性休克、多器官功能障碍，直至患者死亡[11]。线粒体功能障碍促进了脓毒症介导的器官功能不全的发展，线粒体形态改变是其病理特征之一[12]；器官功能恢复也依赖于线粒体功能的恢复，保护线粒体结构和恢复线粒体功能将会为重要脏器功能保护和多器官功能衰竭的治疗提供一种新的理念[13]。研究发现，脓毒症引起的急性肝损伤，TMP对肝细胞线粒体结构的完整性和功能均具有保护作用[14-15]，该作用可能是通过上调肝细胞线粒体内膜的AQP8表达来实现的[4]。本研究通过TMP对脓毒症大鼠预后、线粒体体视学及线粒体内膜AQP8表达的影响，探讨TMP对肝细胞线粒体结构完整性的保护作用并分析其机制。

3.1川芎嗪对脓毒症大鼠预后的影响本研究发现，治疗组和预防组大鼠手术结束至出现脓毒症的时间较脓毒症组长(P<0.01)，即TMP可以延缓实验大鼠脓毒症发作的时间；治疗组和预防组大鼠的存活时间也较脓毒症组大鼠长(P<0.01)，与Guo等[16]研究结果一致；提示TMP可以延缓脓毒症大鼠的重要脏器损害，为原发病治疗赢得时间。治疗组和预防组实验大鼠的术后出现脓毒症时间和存活时间比较差异均无统计学意义，提示用TMP预防脓毒症发生和发展临床意义并不大。

3.2川芎嗪对线粒体的体视学影响本研究中，脓毒症时线粒体形态发生明显变化，线粒体的体积增大，嵴肿胀明显、空泡样变，直至线粒体外膜破裂，发生脂肪变性。脓毒症组、治疗组和预防组单个肝细胞切面的线粒体总数和Nv较对照组明显减少(P<0.01)，但治疗组和预防组的线粒体总数和Nv多于脓毒症组(P<0.01)；提示脓毒症状态下，肝细胞内线粒体的数量减少明显；TMP治疗可以减轻线粒体结构破坏，减少脂肪变性的发生，对线粒体具有保护作用。线粒体Vv在脓毒症组也较对照组小(P<0.01)，与线粒体发生脂肪变性后其数量减少有关；治疗组及预防组和对照组间差异无统计学意义(P>0.05)，是由于治疗组及预防组线粒体数量虽有减少，但线粒体肿胀程度加大，体积增大，导致Vv减少并不明显。线粒体的Sv在4组间差异无统计学意义(P>0.05)，这与Sv的计算方式有关；脓毒症组肝细胞内线粒体的分布是不均衡的，尽管线粒体的数量减少，但Sv计算必须要在有完整线粒体的局部区域进行，加之线粒体肿胀，体积增大，因而在Sv这一指标上4组间差异并不明显；相关研究也有类似情况报告[17]。

3.3川芎嗪对线粒体内膜AQP8表达的影响和对照组比较，线粒体内膜AQP8的相对表达量在脓毒症组、治疗组和预防组均降低(P<0.01)；治疗组和预防组的线粒体AQP8表达量较脓毒症组增多(P<0.01)，治疗组和预防组之间差异无统计学意义(P>0.05)。研究表明在肝脏线粒体内膜的AQP8通道能透过水和氨，并且AQP8起着水合作用并参与线粒体代谢[18]。而脓毒症组大鼠的AQP8表达显著降低，认为AQP8表达下调导致线粒体内水的转运障碍，线粒体内渗透压发生改变，引起的线粒体肿胀，病情进一步发展出现线粒体外膜破裂和脂肪变性。尽管脓毒症组大鼠单个肝细胞切面线粒体总数和Nv减少，因检测AQP8制备裂解液使用的线粒体蛋白浓度相同，不认为是由于线粒体数量减少而引起的AQP8量降低。TMP对肝细胞线粒体结构的保护作用机制可能是通过上调AQP8表达来实现的。

综上所述，脓毒症介导的器官损伤早期特征是没有细胞死亡和结构损伤的功能障碍，此时给予有效治疗，机体尚具有恢复器官功能的能力[19]。脓毒症介导的急性肝损伤病理过程中，线粒体是早期受损的细胞器之一，线粒体正常功能依赖于膜结构的高度完整性[20]。川芎嗪通过上调线粒体内膜AQP8表达而起到保护线粒体结构完整性的作用，对脓毒症介导的急性肝损伤起到保护作用；调节线粒体内膜AQP8含量来改变线粒体形态学是一种全新的治疗理念。

(本文图1~3见插图4-3)

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