桑国俊，邱忠玉，郭海龙，王 珂，容维中

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃 平凉744000）

牛的繁殖方式包括本交和人工授精，人工授精又分鲜配和冻配，利用细管冻精进行远程和集中实施人工授精是最主要的牛群繁殖方式。因此，细管冻精的质量是确保人工授精受胎率的关键环节。细管冻精的质量受供精公牛健康状况、饲养水平、精液品质、细管冻精制作环节和保存条件的影响，这些环节中除细管冻精制作外都可以进行人工标准控制和实施，而细管冻精制作环节受冷冻液、冷冻方法的影响较大。常规冷冻液的冷冻保护剂为甘油和蛋黄，在应用中存在黏度过大、蛋黄脂肪颗粒大而不均匀，影响精子运动速率的问题，本试验的目的是筛选出一种黏度较小的新型冷冻保护剂，在不影响精液冷冻效果的前提下，提高精子的运动速率，提高人工授精的受胎率。

近年来的研究表明，在细胞、胚胎冷冻过程中，为了克服低温对胚胎等微小生命的打击，减少或消除细胞和组织间冰晶的形成，必须在培养液中添加一定量的抗冻剂。以前使用的主要是二甲基亚砜（DMSO）或甘油（GL），但是均对细胞或胚胎产生了一定的毒副作用，其中DMSO 的毒性比GL 强，所以现多用GL。乙二醇（EG）是近年发现的一种新型抗冻剂，用EG 冷冻时，细胞产生的冰晶更少；同时发现，EG 对细胞的毒副作用较小。本研究将在现有研究基础上，多梯度研究EG 保护精子的最优剂量（精子活力和质量最高时的EG 用量），用EG 替代GL。

1 材料与方法

1.1 种公牛

种公牛来自甘肃省宁县兴旺牧业牧业有限责任公司种牛场，包括西门塔尔牛（002 号）、夏洛来牛（11号）、早胜牛（03号）；甘肃省畜牧兽医研究所牛场的秦川牛（02号）。

1.2 采精、运输、冷藏冷冻设备、试剂

台牛、人工采精器械、专用保温箱、吸管、0.25 mL麦管、冰箱、冷冻仪；乙二醇（EG）、甘油（GL）、TCM199、果糖（Fructose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）、柠檬酸、柠檬酸钠、丙酮酸钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、三羟基氨基甲烷（Tris）、双蒸水、新鲜精制卵黄（磁力搅拌器搅拌10 min 以上过滤备用）、80万IU 青霉素钠（Penicillin Sodium）、泰乐菌素（Tylosine）等。利用台牛人工采精，采集后的精液立即用专用保温箱转移到实验室，按照程序进行稀释、分装后在冰箱冷藏室进行平衡处理和冷冻保存。

1.3 冷冻剂配制

传统配方（对照组）：第一液：蒸馏水100mL，柠檬酸钠2.97g，卵黄10mL；第二液：取第一液41.75 mL，加入果糖2.5g，甘油7mL。

试验配方（试验组）：第一液（同对照组）：蒸馏水100mL，柠檬酸钠2.97g，精制卵黄10 mL；第二液：取第一液41.75mL，加入果糖2.5g，乙二醇EG的试验范围为5～9mL。

1.4 解冻效果评定

对试验样本按照试验设计顺序，在冷冻保存的24h时间点进行解冻，观察解冻后的活力、精子形态、精子运动状态进行观察测定，同时观察评定解冻后精子的持续运动能力，其判断标准为精子直线运动的比率和运动速度。

1.5 试验设计

结合试验测定时已经掌握的技术和试验目的，设计了分别以GL、EG 为冷冻剂时牛精液冷冻效果测定试验，其配方见表1和表4，2组各设计了12组配方。每个水平测定10次（重复），每次制作100支细管冻精，从中随即抽检10枚，每次抽检测定均在制冻后24h 进行。试验资料用SPSS 统计分析，LSD 法进行显著性检验。

2 试验结果

2.1以甘油（GL）为冷冻保护剂时的精子冻存效果

2.1.1 配方组合 在传统配方的基础上，适当添加了泰乐菌素、VC、蔗糖和安钠加。

各组合配方详见表1。

表1 以甘油（GL）为冷冻保护剂的配方组合

泰乐菌素为新一代兽药专用抗生素，抗菌谱广，药源性免疫反应低；VC 和安钠加具有较高的抗氧化作用，均有利于精子存活和延长精子存活期。设计不同配方组合的目的是在测定传统配方效果的同时，还可对比测定添加其他成分后精子的保存效果，为完善该类型配方提供资料。

2.1.2 不同浓度GL 细管冻精解冻效果 按照试验设计设定的时间，对冻存24h后的试验冻精进行解冻。解冻时先准备好30℃水浴，将细管冻精在水浴中搅动2～3s解冻，用细管剪剪掉细管两端封口，分别在安排时段提取该管解冻精液抹片观察和记录，观察温度为25℃。

每组配方测定3枚细管冻精，对GL 浓度相同的组合并统计。解冻效果统计详见表2。

表2 以甘油（GL）为冷冻保护剂时冻存冻精的解冻效果

测定结果表明：①不同浓度GL 组的冻精解冻活力不同。0h活力GL0.8、GL1.0、GL1.2高于其他组（P＞0.05）；6h活力GL1.2、GL1.4高于其他组（P＞0.05）；48h活力GL0.6、GL1.0最高，高于GL0.4、GL1.4（P＜0.05）和L0.8、GL1.2（P＞0.05）。

②活力衰减速率不一致。各组在0～6h期间的活力比较稳定，6～30h期间活力迅速下降，而在30～48h 期间的活力又趋于稳定。活力达到0.2以上的只有GL0.6、GL1.0和GL1.2组，其他各组的活力已经明显下降。③30h后的活力出现反弹。这是试验过程中出现的一种可视现象，并不能说明此时精子的受精能力提高了。其原因是部分低活力精子已经死亡沉淀，精子浓度已经降低，视野中可见精子数量减少，给人一种运动精子比例提高的错觉形成的。

2.1.3 相同浓度GL 细管冻精解冻效果 本项试验中，在测定不同浓度GL的同时，在平行配方中还添加了葡萄糖（Glucose）或安钠加。其中1、3、5、7、9号添加了葡萄糖，12号添加了安钠加。测定结果见表3。

表3 同浓度GL组其他组分变化与活力测定统计

测定结果表明：①在0～12h、36～48h阶段，添加葡萄糖组合的活力显著低于未添加组（P＜0.05），但在12～36h 阶段的差异却不显著（P＞0.05）。②在配方12中添加了安钠加，试验数据并未反映出其活化价值。

2.2 以乙二醇（EG）为冷冻保护剂时的精子冻存效果

2.2.1 配方组合 乙二醇系列配方与甘油的相似，将甘油替换为乙二醇。配方详见表4。

2.2.2 不同浓度EG 细管冻精解冻效果 细管冻精的冻存和解冻及测定方法同GL 组。解冻效果详见表5。

表4 以乙二醇（EG）为冷冻保护剂的配方组合

表5 以乙二醇（EG）为冷冻保护剂时冻存冻精的解冻效果统计

测定结果表明：①不同浓度EG 组的冻精解冻活力不同。0h活力EG0.7、EG1.0组高于其他组（P＞0.05）；6h 活 力EG0.7 高 于 其 他 组（P ＜0.05）；48h活力EG1.2最高，高于EG0.4、EG0.6、EG0.7、EG0.8（p＜0.05）和EG1.0（p＞0.05）。②活力衰减速率不一致。各组在0～6h期间的活力比较高，6～12h期间活力迅速下降，而在12～48h期间的活力又趋于稳定并缓慢下降。活力达到0.1以上的只有EG1.2和EG1.0组，其他各组的活力已经明显下降。活力下降最快的是EG0.7组。该组配方中将卵黄用Tris替代，表明Tris的作用不如卵黄。③12h后的活力下降比较缓慢，这与GL各组的试验结果接近，原因也一致。

2.2.3 相同浓度EG 细管冻精解冻效果 本项试验中，在测定不同浓度GL的同时，在平行配方中还添加了葡萄糖（Glucose）或Tris。其中1、3、5、7、9、11号添加了葡萄糖，5、6号添加了Tris。测定结果见表6。

表6 同浓度EG 组其他组分变化与活力测定统计

测定结果表明：

①在0～18h阶段，添加葡萄糖的1、3组合的活力显著低于未添加组（P＜0.05），在18～48h阶段的差异却不显著（P＞0.05）。

②在0～18h阶段，添加葡萄糖的7、9、11组合的活力高于未添加组（P＞0.05），在18～48h阶段的差异不明显（P＞0.05），但活力均高于1、3组，说明EG 的用量以1.0、1.2时比较合适。③在配方5、6中添加了Tris，试验数据显示其活力衰减非常快。其配方中缺少卵黄，缓冲能力有限。

2.3 EG 和GL细管冻精解冻效果比较

对不同比例的EG 和GL与冻精解冻活力的关系测定后，进一步对比分析EG 组和GL 组之间的比较效果。对2组解冻活力的统计详见表7，其趋势示意图见图3。

对每组36 份样本的统计资料表明，EG 组和GL组在解冻活力方面还是存在差异，GL 组的活力高于EG 组，其中在0h、30h阶段的差异不显著（P＞0.05），其它阶段的差异极显著（P＜0.01）。

表7 同浓度EG 组其他组分变化与活力测定统计

3 讨论

通过本次对EG 和GL组及其对比试验表明：

3.1 EG 和GL 对牛精子均有良好的冷冻保护能力。以解冻后6h阶段测定的活力为例，GL组中以GL1.2（换算浓度为12%，下同）和GL1.4的活力最高，均为0.50；EG 组中以EG0.7（换算浓度为7%，下同）时的活力最高，达到0.53。高于国标人工授精时精子活力应该达到0.35以上的标准。据易康乐报道，在不同浓度的乙二醇对水牛精子活力的影响进行比较中，2%组要低于4%（P＜0.01）和6%组（P＜0.05），而4%浓度的乙二醇要高于6%组（P＜0.05）；4%浓度的乙二醇与7%浓度的甘油进行比较试验，两组在精子解冻后的活力、分裂率、囊胚率和囊胚孵化率等方面无显著差异（P＞0.05）。蔡虹为了比较甘油（GL）、乙二醇（EG）和二甲基酰胺（DA）三种抗冻保护剂联合应用于肉牛精液的冷冻保护效果，分别设置了1%、3%、5%三个浓度进行正交组合，结果发现1%GL＋3%EG＋3%DA 组合冷冻效果最好（冻后活力达0.40），高于对照组（P＞0.05）。这些研究结果与本试验的结果趋于一致，表明不仅GL，而且EG 也对牛精液有良好的冷冻保护作用，可以用作精子冷冻保护剂用于制作牛细管冻精。

3.2 其他营养成分的变化对EG 和GL 保护精子的效果有一定影响，特别是卵黄的作用在营养组份中的作用比较明显。卵黄的成分比较复杂，其中的卵磷脂对精子的保护作用比较明显。本试验中，添加卵黄的试验组活力均高于未添加组，高剂量卵黄组高于低剂量卵黄组，这在表3和表6统计资料中均有明显反映。同时，添加葡萄糖、Tris、安钠加等均不利于精子冷冻保存。据杨俊涛等报道，用1.50%的大豆卵磷脂取代卵黄进行精子的冷冻保存，解冻精子的活力可以达到0.35以上，但无大豆卵磷脂时的活力较低，也表明卵黄或其他类型的卵磷脂对精子的冷冻保存非常重要，可显著提高精子的活力。

3.3 在同等条件下，GL 对精子的冷冻保护效果优于EG，EG 组的活力衰竭快于GL组。

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