顾贵波，于学武，谭立文，陈 瑶，魏 澍，赵 培，王 竹，魏园园，曹明慧

（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳110164 ；2.大连市动物疫病预防控制中心，辽宁 大连116037；3.中国兽医药品监察所，北京 海淀100081）

1974 年，德国科学家Tischer 在多株连续传代PK-15 细胞系（ATCC-CCL31）中发现猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）。PCV 有PCV-1 和PCV-2两个血清型，其中，PCV-2 感染可引起多种综合征疫病，主要包括PMWS、PDNS、SAMS、PRDC[1]、CT[2]、坏死性淋巴腺炎及渗出性皮炎[3]等多种疾病，这些疾病被统称为猪圆环病毒病（PCVD），或统称为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）。

目前，PCVD 已在全球均有发生，给世界养猪业带来的经济损失巨大，自1991 年加拿大萨斯喀彻温省首次报道本病以来，世界各地也相继出现

了有关本病的报道，包括美国、法国、英国、西班牙、丹麦、瑞士、意大利、荷兰、日本、韩国等二十多个国家；虽然全球众多国家和地区都存在圆环病毒病，以及由PCV2 引发的相关疾病，但各地的流行态势和毒株分布存在有较大差异[1]。郎洪武等[4]证实我国猪群PCV2 感染达42.9%以上。王忠田等[5]对从我国所分离的6 株PCV2 毒株的病毒核酸同源性均在95%以上，与欧美毒株同源性为94.4%～99.7%。我们应用现代分子生物学技术，对在辽宁省猪群PCV2 的流行情况及基因遗传演化进行调查分析，为辽宁地区猪群PCVD 诊断、综合防制及研究提供重要的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料 DNA Marker DL-2 000、E.coli JM109 感受态菌等为宝生物工程（大连）有限公司产品。猪圆环病毒Ⅱ型荧光PCR 检测试剂盒（TaqMan 探针法）为北京生科尚仪科技有限公司产品。

1.2 辽宁猪群PCV-2 流行情况调查 对辽宁14个地区的门诊、屠宰场，针对PCV-2 进行流行病学调查，采集相应的组织病料，低温冷藏条件下，快速运送至实验室，用于PCV-2 核酸检测。

1.3 PCV-2 全基因序列扩增与分析 参照文献[6]建立的PCV-2 全基因序列PCR 扩增方法，选取PCV-2 阳性样品扩增其全基因序列，检测PCR 产物，纯化的PCR 产物与pMD-18T Vector 连接，然后转化E.coli JM109 感受态细胞，经PCR 鉴定后，送宝生物工程（大连）有限公司测定其核苷酸序列。应用DNAStar 软件对测定的序列与GenBank中收录来自欧洲、美洲、亚洲以及中国的具有代表性毒株序列进行同源性与进化分析。引物序列及扩增片断大小见表1。

表1 引物序列及其扩增片断

PCR 反应体系为50 μL，体系组成如下：2×GC BufferⅠ25.0 μL、灭菌ddH2O 10.5 μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）8.0 μL、LA Taq（5U/μL）0.5 μL、PCV-2 QC-F（20 μmol/L）1.0 μL、PCV-2 QC-R（20 μmol/L）1.0 μL、DNA 4.0 μL。

反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1min，共35 个循环；72 ℃终延伸10 min。取5 μL PCR 产物用于电泳检测。1.4 数据处理 采用SSPS17.0 处理数据，做卡方检验及F 检验，分析组间差异。

2 结果与分析

2.1 辽宁猪群PCV2 流行情况

2.1.1 临床发病猪群组织样品PCV-2 核酸检测结果 2008-2012 年对来自辽宁地区3336 份门诊病例猪组织样品进行PCV-2 核酸检测，平均阳性率为58.99%，分别对不同年度、地域及全省总体阳性率情况进行卡方检验分析，不同年度间全省、辽中、辽北及辽东地区均无统计学差异（P＞0.05），而辽南、辽西地区渐近性差异显著（P=0.028；P=0.006）；2008-2012 年各年度不同地域间均无统计学差异（P＞0.05）（表2）。

2.1.2 临床健康猪群组织样品PCV-2 核酸检测结果

2010-2013 年采自屠宰场的930 份猪组织样品进行核酸检测，总体阳性率为64.07%；其中，2010-2013年核酸阳性率分别为44.29%、55.11%、72.80%和85.67%（表3）；呈逐年上升趋势，统计分析表明，各年度核酸阳性率渐近性差异显著（P=0.014）。

表2 不同地区临床发病猪组织病料PC V-2核酸检测阳性率

表3 临床健康猪组织样品PC V-2核酸检测阳性率

2.2 PCV-2 全基因组的扩增与序列测定分析

2.2.1 PCV-2 全基因组的扩增与序列测定 应用扩增PCV-2 全基因序列的PCR 引物，分别从组织病料和细胞培养物中扩增到位于2 000 bp 附近特异条带，与预期大小相符（图1）。应用病毒分离鉴定和PCR 扩增方法，最终得到11 株辽宁毒株（以下简称LN-PCV-2 毒株）的全基因序列，其中2012 年6 株，2013 年5 株（表4）；测序结果表明，其长度为1 767 或1 768 bp。

图1 LN-PC V-2毒株全基因序列扩增结果

表4 2012年和2013年LN-PC V-2毒株

2.2.2 PCV-2 全基因组序列分析 应用DNAStar软件，将11 株LN-PCV-2 毒株全基因序列同选自GenBank 中收录来自欧洲、美洲、亚洲以及中国的具有代表性的19 株PCV-2 毒株（国外11 株，国内8 株）进行同源性与进化分析。结果表明，11 株LN-PCV-2 毒株之间同源性为94.5%～99.4%；2012 年6 株LN-PCV-2 毒株间同源性为95.4%～99.4%，2013 年5 株LN-PCV-2 毒株间同源性为95.2%～99.3%；辽东地区2 株间同源性为98.2%，辽南地区2 株间同源性为95.9%，辽西地区2 株间同源性为96%，辽北地区3 株间同源性为95.7%、95.1%和98.5%，辽中地区2 株间同源性为95.1%。

与国内毒株相比，与处于同一地理区域的东北PCV-2 毒株同源性为95.3%～99.4%；与毗邻的华北地区PCV2 毒株间同源性为94.6%～99.6%；与华东、华南、华中、西北和西南PCV2 毒株间同源性分别为94.8%～99.7%、95.2%～99.3%、94.5%～96.5%、94.6%～99.5%和94.8%～99.4%。

与国外PCV-2 毒株间同源性为94.3%～99.3%，其中，与欧洲PCV-2 毒株间同源性为95%～98.4%，与美洲PCV-2 毒株间同源性为94.3%～99.3%，与同处于亚洲朝鲜半岛PCV-2 毒株间同源性为94.5%～96.6%；在国外毒株中，与法国PCV-2 毒株同源性相对较高（95.4%～99.3%），而与加拿大的PCV-2 毒株同源性相对较低（94.3%～97%）。

根据Olvera 等[7]分型标准，11 株LN-PCV-2 毒株中有9株属于PCV-2b基因型，其中属1A/1B亚群（型）7 株，1C亚群（型）2 株；另2 株属于PCV-2a 基因型。按年度分布，2012 年6 株PCV-2 毒株中，PCV-2b 基因型1A/1B 亚群4 株，另2 株为PCV-2a 基因型；2013年5 株PCV-2 毒株中，PCV-2b 基因型1A/1B 亚群3株，PCV-2b 基因型1C 亚群2 株。按地域分布，辽东地区2 株，均属于PCV-2b 基因型1A/1B 亚群；辽南地区2 株，分别属于PCV-2b 基因型1A/1B 亚群和1C亚群；辽西地区2 株，分别属于PCV-2b 基因型1A/1B亚群和1C 亚群；辽北地区3 株，PCV-2b 基因型1A/1B 亚群2 株，PCV-2a 基因型1 株，辽中地区2 株，分别属于PCV-2b基因型1A/1B亚群和PCV-2a基因型。

3 讨论

3.1 英国于1993 年首次暴发由PCV-2 感染引起的PDNS，自1999 年后，PMWS 在英国呈上升 趋势，平均发病率为25%，而最高可达40%，由其造成的经济损失比猪瘟和口蹄疫还要大[8]。张志等[9]调查表明，国内猪群PCV-2 感染率逐年攀升，最高达90%以上，屠宰场采集的组织样品也高达60%。通过对辽宁省临床发病和临床健康猪群的组织样品进行检测，平均阳性率分别为58.99%和53.81%，且呈逐年上升趋势，表明在辽宁地区猪群中普遍存在PCV-2 感染，污染面逐年扩大。分析比对临床发病猪群与临床健康猪群检测结果发现，临床健康猪群PCV-2 阳性率与临床发病猪群相当，进一步证实了PCV-2 有隐性感染的特点，辽宁地区临床健康猪群中有大量的PCV-2 隐性感染或/和亚临床感染猪，应引起足够的重视。

3.2 全基因序列同源性分析表明，不同年度、不同地域毒株全基因序列的同源性较高，表明近2年来辽宁流行的PCV-2 毒株没有明显的空间和时间特征，而且，至少存在3 个亚型，PCV-2b 为主要流行基因型；同一时期辽宁猪群中存在着不同进化阶段的PCV-2 毒株流行，与文献报道的国内其他地区情况也基本一致[10]。11 株LN-PCV-2 毒株与国内、外PCV-2 毒株变异程度均不大，表明PCV-2 流行毒株没有地域意义。由基于全基因序列的系统进化树可知，11 株LN-PCV-2 毒株散布于两大基因型中，其分散程度与19 株国内外PCV-2 参考毒株相当，表明国内PCV-2 毒株来源可能较广泛，一些可能由美国、加拿大等国传入；另一部分可能源于欧洲，但这一观点还需通过分析更多PCV-2 毒株序列进一步证实；同时，也表明辽宁猪群中PCV-2 流行情况比较复杂。

[1] Grau-Roma L，Fraile L，Segalés J.Recent advances in the epidemiology，diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type 2[J].Vet，2011，187（1）：23-32.

[2] Stevenson G W，Kiupel M，Mittal S K，et al.Tissue distribution and genetic typing of porcine circoviruses in pigs with naturally occurring congenital tremors[J].Vet Diagn Invest，2001，13（1）：57-62.

[3] Smith W J，Thomson J R，Done S.Dermatitis nephropathy syndrome of pigs[J].Vet Rec，1993，132（2）：47.

[4] 郎洪武，张广川，吴发权，等.断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J].中国兽医科技，2000，30（3）：3-5.

[5] 王忠田，郭鑫，杨汉春，等.六株猪圆环病毒2 型国内分离株的全基因组序列测定与分析[J].农业生物技术学报，2005，13（1）：56-60.

[6] 陈庆新，周继勇，叶菊秀，等.猪Ⅱ型圆环病毒浙江株的分离及全基因组结构分析[J].微生物学报，2004，44（4）：526-529.

[7] Olvera A，Cortey M，Segalés J . Molecular evolution of porcine circovirus type 2 genomes：phylogeny and clonality[J].Virology，2007，357（2）：175-185．

[8] Edwards S，Sands J J.Evidence of circovirus infection in British pigs[J].Vet Rec，1994，134（26）：680-681.

[9] 张志，刘爽，吴发兴，等.2011 年我国猪病流行特征分析[J].猪业科学，2012，2：52-53.

[10] 于学武.辽宁省规模化养猪场猪圆环病毒2 型感染流行病学调查及其研究[D].哈尔滨：东北农业大学动物医学学院，2013．